漿水中乳酸菌分離鑒定及其代謝特性的初步研究

孟憲剛,李雪萍,李建宏,謝佳佳,鄭 楠

(蘭州交通大學化學與生物工程學院,甘肅蘭州 730070)

漿水中乳酸菌分離鑒定及其代謝特性的初步研究

孟憲剛,李雪萍,李建宏,謝佳佳,鄭 楠

(蘭州交通大學化學與生物工程學院,甘肅蘭州 730070)

以漿水為材料,運用涂布法和平板劃線法在選擇性培養基上分離純化其中的乳酸菌,并采用生理生化特性鑒定和分子生物學鑒定相結合的方法鑒定其種屬。發現漿水中含有多種乳酸菌,可歸為5屬17種。并用溶鈣圈法選擇17株菌進行產酸、降解膽固醇和亞硝酸鹽實驗,結果表明:實驗菌株大多具有良好的產酸、降膽固醇和降亞硝酸鹽功效,其中Q2、M5、H4、Q7、M2、H1等6株菌各方面性能都很優異,具有進一步開發利用之潛力。

漿水,乳酸菌,多樣性,亞硝酸鹽,膽固醇

漿水是將新鮮的芹菜等蔬菜投放入面湯或米湯后經多種微生物協同發酵而成的一種發酵食品[1]。傳統漿水大多由自然發酵而成[2],在這一過程中不可避免的受到許多因素的制約和影響,例如原材料、加工溫度等。在整個發酵過程中,任何一個環節的不慎都可能導致發酵異常甚至失敗,自然發酵所需發酵時間較長,且發酵質量不穩定,不利于工廠化、規模化及標準化生產。采用人工接種發酵能避免自然發酵的不足,并且是實現漿水生產工業化的較佳加工方法。但目前人工接種發酵漿水的方法尚處于實驗室研究階段。其瓶頸之一是缺乏特性優良的純培養發酵菌種。

乳酸菌是公認的最好的食品發酵菌種之一,乳酸菌不僅可以提高食品的營養價值,改善食品風味,而且可以提高食品保藏性和附加值[3-4]。近年來還發現乳酸菌具有特殊生理活性和營養功能,如:乳酸菌能夠調節機體胃腸道正常菌群[5]、保持微生態平衡,提高食物消化率和生物價[6],降低血清膽固醇,控制內毒素,抑制腸道內腐敗菌生長繁殖和腐敗產物的產生,制造營養物質[6],刺激組織發育,從而對機體的營養狀態、生理功能、細胞感染、藥物效應、毒性反應、免疫反應、腫瘤發生、衰老過程和突然的應急反應等產生作用[7-9];由此可見,乳酸菌的生理功能與機體的生命活動息息相關。可以說,如果乳酸菌停止生長,人和動物就很難健康生存。也正因為如此,乳酸菌被廣泛用于輕工業、食品、醫藥及飼料工業等許多行業上。另外,食品安全和飲食健康問題正日益引起人們的重視,典型的如亞硝酸鹽問題,而有諸多研究表明乳酸菌在活動過程中可有效降解亞硝酸鹽,提高食品安全性[10-12]。因此篩選優良乳酸菌并研究其代謝特性就是非常重要的一項工作。

本文旨在篩選出具有優良功能特性的乳酸菌,綜合運用菌落形態學、生理生化實驗和分子生物學技術對其進行鑒定,隨后研究其產酸特性,降解膽固醇及亞硝酸鹽的能力等,為漿水的功能特性的研究以及優良乳酸菌制劑的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 分別從西北五個地區取樣,取樣時參考當地食用習慣,在漿水處于風味最佳的階段(無泡沫、味酸、漿水清澈、口感清爽)時取樣,取得樣品后,儲存于無菌容器,低溫運輸至實驗室,立即分離,采樣地點如表1所示;細菌基因組DNA提取試劑盒 離心柱型,北京百泰克生物技術有限公司;2000bp DNA Ladder 美國Biomiga公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 美國Sigma公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 美國Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 美國Sigma公司;Trise-飽和酚 美國Sigma公司;瓊脂糖 BBI生物工程股份有限公司;β-巰基乙醇 天津市精細化工研究所 分析純;異戊醇 分析純,上海中秦化學試劑有限公司;PCR擴增試劑 上海生工。

表1 樣品來源Table 1 Source of samples

臺式離心機Centrifuge 5418R 德國艾本德公司;PCR儀MyCycler 美國伯樂生命醫學產品公司;電泳儀HE-120 上海天能科技有限公司;凝膠成像儀2500 上海天能科技有限公司;紫外分光光度計Nano Drop 2000 美國賽默飛世爾科技公司;各型加樣槍 德國艾本德公司;Sorvall legend RT離心機 美國Kendro實驗室產品公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗所用培養基 MRS培養基;M17培養基;TYC培養基。

1.2.2 菌種的分離及篩選 用無菌生理鹽水稀釋漿水樣本(樣本稀釋度以平板表面出現單菌落為度),涂布于平板培養基表面,37℃下培養48h后觀察。挑選單菌落,再次用劃線法分離純化并鏡檢。挑選菌落形態統一、菌體顯微形態一致的菌株進行后續實驗。

1.2.3 菌株表型特征研究及乳酸菌的初步篩選 將1.2.1所選的菌株劃線于平板上,培養至24～48h時觀察并記錄菌落形狀、色澤、隆起、表面平整度、邊緣形狀等;取培養至24～36h的菌落涂片,用三步法做革蘭氏染色,并在油鏡下觀察菌體形狀和顏色(用Staphyloccocusaureus和Escherichiacoli做陽性和陰性對照)。

以上述觀察結果為依據,選擇菌落乳白色、光滑濕潤、圓形,革蘭氏染色結果為陽性的菌株進行進一步研究。

1.2.4 生理生化特征鑒定 將1.2.3所挑選出的菌株活化后,分別做以下實驗[13-14]:接觸酶反應實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、石蕊牛奶實驗、糖發酵實驗、硫化氫產生實驗、吲哚產生實驗和乙酰甲基甲醇(V-P)實驗,準確觀察并記錄實驗結果。根據菌落形態、革蘭氏染色結果及生化特性研究結果,參照《伯杰細菌鑒定手冊》[15]、《常見細菌系統鑒定手冊》[16]查詢各菌株的分類地位。

1.2.5 分子生物學鑒定

1.2.5.1 DNA的提取 細菌用細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取。

1.2.5.2 DNA純度及濃度分析 用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測。

1.2.5.3 設計與合成 細菌擴增引物為細菌16S rDNA擴增通用引物27F-1492R,序列分別為:27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R:5-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3,由北京華大基因研究中心合成。

1.2.5.4 擴增反應 擴增反應在梯度PCR儀上進行PCR反應,反應體系為(25μL):10×buffer緩沖液:2.5μL;l0mmol/L的Mg2+:1.5μL;25mmol/L的dNTP:0.5μL;20μmol/L的 PCR引物各0.5μL;5U/μL的Taq DNA聚合酶:0.25μL;約25ng/μL的模板DNA2.0μL;無菌雙蒸水稀釋至25μL。PCR反應程序為:94℃預變性5min;94℃變性30s;55℃退火60s;72℃延伸30s;重復擴增40個循環;最后72℃延伸l0min;4℃保存。

1.2.5.5 擴增產物的檢測與測序 反應產物檢測通過瓊脂糖凝膠電泳法完成,DNA Marker為2000bp DNA Ladder,將擴增出的產物的測序直接交北京華大基因研究中心完成。

1.2.6 微生物種屬確定 綜合生理生化鑒定結果與分子生物學鑒定結果,確定微生物的種屬。

1.2.7 溶鈣圈實驗 將各菌株活化后點接于含2%碳酸鈣的MRS、M17、TYC培養基中,選取溶鈣圈相對較大的菌株進行后續實驗。

1.2.8 各菌株產酸性能的測定 將各株乳酸菌增菌培養24h后連續活化3代,以2%的接種量接入MRS培養液中,每隔8h取樣測定其pH,測至72h。

1.2.9 各菌株降解亞硝酸鹽性能的測定 采用鹽酸萘乙二胺法[17]做亞硝酸鹽標準曲線,得出標準方程。將連續活化3次后的乳酸菌以2%的接種量接種到含亞硝酸鈉(10mg/L)的培養基中,每12h取樣,采用鹽酸萘乙二胺法[17]測亞硝酸鹽,測至72h,記錄實驗結果,根據標準曲線方程計算亞硝酸鹽的含量。

1.2.10 各菌株降解膽固醇性能的測定 采用鄰苯二甲醛法[18]做膽固醇標準曲線,得出標準方程。將增菌培養連續活化3代后的乳酸菌以2%的接種量接種到高膽固醇培養基中,分別在24、48、72h時取樣,用鄰苯二甲醛法[18]測定膽固醇的含量,準確記錄實驗結果,根據標準方程計算膽固醇含量和降解率。

1.3 數據處理與結果分析

DNA序列使用軟件DNAMAN4.0進行分析;利用clustalx1.83對序列分別進行比對;在clustalx1.83中實現“掐頭去尾”;BLAST獲得相似序列。

亞硝酸鹽降解和膽固醇降解相關數據作圖采用spss19.0軟件完成。

在GenBank獲得與實驗菌株親緣較近的菌株16S rDNA測序作為參比序列,用clustalx1.83進行序列比對,使用MEGA5.1.2構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選與表型特征的鑒定

以形態特征和革蘭氏染色結果為依據,初步篩選出菌落乳白色、光滑濕潤、圓形,革蘭氏陽性的菌株59株。

2.2 生理生化特征鑒定

根據表型特征鑒定結果及生理生化特征鑒定結果,參照《伯杰細菌鑒定手冊》[15]、《常見細菌系統鑒定手冊》[16],查詢其分類地位,結果如表2。

表2 生理生化特性鑒定結果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characterization

鑒定并記錄實驗菌株的接觸酶反應和淀粉水解等9項反應特征,并結合形態特征和革蘭氏染色結果,分別與《伯杰細菌鑒定手冊》[15]和《常見細菌系統鑒定手冊》[16]中描述的反應特征相對比,發現所有實驗菌株在鑒定手冊中均能找到指標完全吻合的對應菌株,大部分甚至能鑒定到種,說明本研究中特征實驗選取恰當,實驗結果準確可靠。

2.3 分子生物學鑒定結果

如表3所示,分子生物學鑒定結果和生理生化特性鑒定結果吻合良好,兩種方法互相印證,說明鑒定準確,而且大部分都鑒定到了種,也說明了分子生物學鑒定方法的優越性。另如圖1所示,從系統發育學的角度,本研究分離出的59株細菌的16S rDNA序列與GenBank中序列的相似度均在98%以上,可以確定其分屬為乳球菌屬Lactococcus、乳桿菌屬Lactobacillus、明串珠菌屬Leuconostoc、鏈球菌屬Streptococcus、短桿菌屬Brevibacterium等5屬17種。說明漿水中乳酸菌多樣性較高。

2.4 溶鈣圈實驗結果

根據乳酸菌降解膽固醇、降解亞硝酸鹽的機理,降膽固醇及亞硝酸鹽菌株都是產酸的,因而采用碳酸鈣平板透明圈法就可以初步篩選能產酸、能降解膽固醇與亞硝酸鹽的菌株,本研究中,結合革蘭氏染色結果和菌落形態觀察結果,選取了溶鈣圈大而明顯的菌株(N8、H8、M15、Q19、L14、L15、Q2、M5、H4、Q7、N12、N3、L11、M2、H1、H16、M14等17株)進行后續研究。

2.5 各菌株產酸性能測定

如圖2所示,本研究分離的各實驗菌株產酸能力和產酸規律差別較大,如N3、N14和L11等菌株培養液中pH始終在5.5左右,而H16、N8等菌培養液pH在72h時降到了4以下。但是總體來看,大部分實驗菌株都具有良好的產酸性能;就產酸規律來看,菌株M14、N12、L11產酸不明顯,菌株N3和M15的pH呈現先降低后升高再降低的趨勢;其余菌株pH均先下降,后逐漸趨于穩定。

2.6 各菌株降膽固醇能力測定

表3 分子生物學鑒定結果Table 3 Molecular identification results

如圖4所示,實驗菌株都有一定的降解膽固醇的能力,且整體呈現隨培養時間延長降解率增高的趨勢。但是,不同菌株其降解率差別較大,如菌株L14在72h的降解率在25%以下,而菌株M2達到了80%以上,相差3倍多。降解能力較強的菌株有:Q2、M5、H4、Q7、M2、H1、M14,其中,M2的最終的降解率高達92.28%。遠超過了前人們從各種樣品中分離的菌種的膽固醇降解率[19],也反映了漿水的優良特性。

圖1 乳酸菌系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Lactobacillus

2.7 各菌株降解亞硝酸鹽能力的測定

亞硝酸鹽是引起發酵蔬菜安全問題的主要原因,由于蔬菜本身含有硝態氮,在某些微生物的活動下很容易產生亞硝酸鹽,而過量的亞硝酸鹽對人體有毒害作用,因此,去除發酵蔬菜中亞硝酸鹽就是發酵蔬菜制作中非常重要的一個方面。如圖5所示,本研究篩選出的菌株都能較好的降解亞硝酸鹽的能力,且培養液中亞硝酸鹽的降解率隨時間延長而增大,另外,不同菌株對亞硝酸鹽的降解率不同。

圖2 各菌株產酸結果Fig.2 Produce acid results of strains

圖3 膽固醇及亞硝酸鹽標準曲線Fig.3 Cholesterol and Nitrite standard curve 注:1.膽固醇曲線:Y=0.003862857142857143x+ 0.0004285714285714389,R2=0.995 (曲線估計時為0.995,直線估計為0.998) 2.亞硝酸鹽標準曲線:Y=0.6787719298245615x+ -0.005321637426900604,R2=0.997 (曲線估計時為0.997,直線估計為0.998)

圖4 實驗菌株降解膽固醇結果Fig.4 The results of experimental strains degraded cholesterol

圖5 實驗菌株降解亞硝酸鹽結果Fig.5 The results of experimental strains degraded nitrite

綜上,就產酸、降解膽固醇和降解亞硝酸鹽性能等綜合來看,較為突出的菌株有乳酸乳球菌3株,分別為:Q2(乳酸乳球菌乳脂亞種Lactococcuslactiscremoris)、M2(乳酸乳球菌乳亞種Lactococcuslactislactis)和H1(乳酸乳球菌乳亞種Lactococcuslactislactis),乳酪短桿菌2株:M5(乳酪短桿菌Brevibacteriumcasei)和H4(乳酪短桿菌Brevibacteriumcasei),另有一株菌Q7(棉籽糖乳球菌Lactococcusraffinolactis)。以上幾株菌都是較為常見的乳酸菌,其中乳酸乳球菌在食品和藥物生產中都有極廣泛的應用,如在乳制品的發酵[20]、生物化工產品的生產[21]、醫療及科研[22]等。而棉籽糖乳球菌和乳酪短桿菌的應用目前報道還較少。本研究結果顯示了以上6株菌在諸多方面都有優良的表現,因此,是極有開發利用前途的微生物資源。

3 討論

如上所述,本研究所分離菌種大多是具有潛在優良功效的乳球菌或乳桿菌,如益生功效[23],張莉等[24]以植物乳桿菌K25和C88為菌種,研究了乳酸菌的益生功效,結果表明:植物乳桿菌C88具有調節腸道菌群的作用,而植物乳桿菌K25干酪有助于降低心血管疾病的發生率。另有張董燕等[25]的研究表明乳桿菌能夠提高生長豬氮表觀消化率,改善血清指標,減少應激。諸如此類,大量的研究證據都顯示乳酸菌具有出色的益生功效,總結起來,可以歸結為促進胃腸道健康、促進膽固醇降解、增強免疫力、延緩衰老等幾個方面;除此之外,乳酸菌還具有改善蔬菜品質的功效,研究發現,經乳酸菌活動后,蔬菜風味得以改善[26]、蔬菜安全和營養價值得以提高[27-29]等。除了上述兩個方面的作用外,某些乳酸菌還可產生細菌素,是良好的生物保鮮劑,其具有抗菌保鮮作用且對人體無毒副作用,可以防止漿水的霉變腐敗,可改善食品質量和食品安全的天然化合物,具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值[30-31]。如研究發現[32]戊糖乳桿菌產生的戊糖乳桿菌素對部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有較強抑制作用,因其抑菌譜較廣,對多數致病菌和食品腐敗菌有較好抑菌作用,目前已有小規模的應用。但是另一方面,不同菌株之間的差別是很大的,因此,本研究分離出菌株的功效還需進一步實驗論證。

本研究產酸實驗中,菌株N3和M15的pH呈現先降低后升高再降低的趨勢,這一結果與理論預測和前人研究得出的規律[33]相反,其可能的原因之一是雜菌污染,但其后經過多發酵液中微生物鏡檢和菌落形態檢驗,未發現雜菌,且重復實驗均出現這一現象,可排除雜菌污染的可能。因此,其最可能的原因就是該菌株本身代謝特性較為特殊,需要從該菌酶系組成加以研究。

4 結論

4.1 漿水中含有多種乳酸菌,可歸為5屬17種。

4.2 實驗菌株大多具有良好的產酸、降膽固醇和降亞硝酸鹽功效,但不同菌株產酸、降膽固醇和降亞硝酸鹽的能力各不相同。

4.3 Q2(乳酸乳球菌乳脂亞種Lactococcuslactiscremoris)、M5(乳酪短桿菌Brevibacteriumcasei)、H4(乳酪短桿菌Brevibacteriumcasei)、Q7(棉籽糖乳球菌Lactococcusraffinolactis)、M2(乳酸乳球菌乳亞種Lactococcuslactislactis)、H1(乳酸乳球菌乳亞種Lactococcuslactislactis)等6株菌各方面性能都很優異,具有進一步開發利用之潛力。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from Jiangshui and preliminary study on metabolic characteristics

MENG Xian-gang,LI Xue-ping,LI Jian-hong,XIE Jia-jia,ZHENG Nan

(College of Chemistry and Bioengineering Sciences,Lanzhou jiaotong University,Lanzhou 730070,China)

Jiangshui as the experimental material and Lactic acid bacteria(LAB)were isolated and purified on the selective culture medium by spread plate method and streak plate method. The species were identified by combining physiological and biochemical characteristics and molecular biology method. It found that there were various lactic acid bacteria which were classified into 5 genus and 17 species in Jiangshui. 17 LAB strains were selected by calcium-dissolving and the strains were used for produced acid,degraded cholesterol and nitrite experiment. The results showed that most of the selected strains had good produced acid,degraded cholesterol and nitrite ability,which Q2,M5,H4,Q7,M2,H1 were better in all aspects,with a potential of development and utilization.

Jiangshui;lactic acid bacteria;diversity;nitrite;cholesterol

2014-01-09

孟憲剛(1974-)，男，教授，博士，研究方向：食品發酵工程。

2012甘肅省財政廳生物專項項目(213001)；2011甘肅省財政廳高等學校基本科研業務費項目(211135)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0181-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.029