超聲輔助雙水相體系提取花椒果皮總生物堿研究

張丙云,魏俊青,郭 濤,黃 艷,王 雅,馬建蘋,王鳴剛,趙 萍,孫 莉,謝鵬燕,何 蕾

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

超聲輔助雙水相體系提取花椒果皮總生物堿研究

張丙云,魏俊青,郭 濤*,黃 艷,王 雅,馬建蘋,王鳴剛,趙 萍,孫 莉,謝鵬燕,何 蕾

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

目的:優化超聲輔助雙水相體系提取花椒果皮總生物堿工藝。方法:以酸性染料比色法分析,使用超聲輔助正丙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取花椒果皮總生物堿,以提取時間、超聲功率和液固比為因素,以得率為響應值,以Box-Benhnken原理探索最佳工藝。結果:最佳提取工藝為:提取時間46min,超聲功率250W,液固比22∶1,此條件下總生物堿得率為18.87mg/g,比回流提取法總生物堿得率高38.75%,純度高39.64%。結論:優化出一條全新的花椒果皮總生物堿最佳提取工藝過程,為花椒果皮總生物堿的進一步開發奠定了良好的基礎。

花椒,雙水相體系,生物堿,酸性染料比色法,超聲輔助提取

花椒(Zanthoxylumbungeanum)屬于蕓香科花椒屬(Zanthoxylum)植物,是該屬植物的代表植物,也是我國特有的食用香辛料之一[1-2]?；ń返墓麑?、枝、葉等均可入藥。藥典記載,花椒有“溫中止痛,殺蟲止癢”的功效[3]?；ń吩谖覈植紡V泛,主要栽培品種有大紅袍、大花椒、白沙椒等[4]。

生物堿是花椒屬的主要活性成分之一。該屬生物堿主要有四大類:喹啉衍生物類(Ⅰ)、異喹啉衍生物類(Ⅱ)、苯并菲啶衍生物類(Ⅲ)和喹諾酮衍生物類(Ⅳ)。已有研究證實花椒果皮中生物堿主要有白屈菜紅堿、香草木寧堿、白鮮堿、茵芋堿等[5-6]。目前對該屬植物生物堿類成分的研究報道很多,這些生物堿成分具有抑菌、抗癌、解痙等多種活性。

雙水相萃取技術(aqueous two-phase extraction,ATPE)是將兩種化學結構不同的親水性聚合物或聚合物和無機鹽在水中形成互不相溶的兩相[7-8],具有分相時間短,萃取條件溫和,有機溶劑殘留少,對目標產物選擇性強,易放大,可以實現分離和富集一步完成等特點[9-10],廣泛用于蛋白質、氨基酸、酶、核酸等生物活性物質的分離純化[11-13]。近年來,雙水相萃取技術逐漸應用到天然產物的分離純化中[14]。

為了提高花椒果皮中總生物堿的提取率和純度,筆者以超聲輔助雙水相體系響應面分析法對總生物堿提取工藝進行優化研究,為其進一步開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒(Zanthoxylumbungeanum)采集于陜西省鳳翔縣唐村鄉,經郭濤副教授(蘭州理工大學)鑒定為植物花椒(Zanthoxylumbungeanum)的果皮。

白鮮堿標準標準品 純度>98%,上海盛中醫藥化工有限公司;溴百里香草酚藍 天津市光復精細化工研究所;磷酸氫二鉀,磷酸氫二鈉,檸檬酸均為分析純 天津市百世化工有限公司;正丙醇,甲醇,氯仿試劑均為分析純 天津市富宇精細化工有限公司。

KH-600DE型數控超聲波 昆山禾創超聲儀器有限公司;SHB-IIIA型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工有限公司;RE52-86A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;AB104-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;Varian Cary 50紫外可見分光光度計 美國瓦里安技術中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的制備 精密稱取白鮮堿標準品4.0mg,用甲醇溶解定容于100mL容量瓶,配制成0.04mg/mL的白鮮堿標準品溶液。精密吸取標準品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL分別置10mL容量瓶中,加甲醇定容,搖勻。配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/mL的標準系列溶液。

1.2.2 酸性染料比色法條件選擇

1.2.2.1 檢測波長的選擇 精密吸取標準品溶液0.5mL于分液漏斗中,加入pH=6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5mL,溴百里香草酚藍溶液2mL及氯仿10mL,劇烈搖振后靜置,以氯仿作空白,用紫外可見分光光度計在200～800nm處全波長掃描。

1.2.2.2 酸性染料用量的選擇 精密吸取標準品溶液0.5mL于分液漏斗中,加入pH=6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5mL,分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL的溴百里香草酚藍溶液及氯仿10mL,劇烈搖振后靜置,以氯仿作空白,在415nm波長檢測。

1.2.2.3 緩沖液pH的選擇 精密吸取標準品溶液0.5mL于分液漏斗中,分別加入pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5mL,溴百里香草酚藍溶液5mL,氯仿10mL,劇烈搖振后靜置,以氯仿作空白,在415nm波長檢測。

1.2.2.4 緩沖液用量的選擇 精密吸取標準品溶液0.5mL于分液漏斗中,分別加入體積為1、2、3、4、5mL的pH=5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,溴百里香草酚藍溶液5mL及氯仿10mL,劇烈搖振后靜置,以氯仿作空白,在415nm波長檢測。

1.3 標準曲線的繪制

分別吸取濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/mL的白鮮堿標準系列溶液0.5mL,加入pH=5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液3mL,加入5.0mL的溴百里香草酚藍溶液及氯仿10mL,劇烈搖振后靜置,以氯仿作空白,分別在415nm處測定其吸光度。以白鮮堿標準溶液濃度(μg/mL不用標出)為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y)作圖。

1.4 雙水相體系優化

在前期預實驗的基礎上,選擇正丙醇(NPA)/磷酸氫二鉀(K2HPO4)雙水相體系。通過單因素實驗,考察不同比例的正丙醇(7%、10%、18%、21%、24%、27%)和磷酸氫二鉀(12%、16%、19%、22%、25%、28%)對總生物堿得率的影響,確定最優(NPA)/(K2HPO4)體系。

1.5 單因素實驗設計

1.5.1 提取時間對花椒果皮總生物堿得率的影響 準確稱取1g花椒果皮粉末(液固比20∶1),加入雙水相體系中于40℃恒溫水浴下分別超聲(200W)提取15、30、45、60、75min,過濾,濾液離心分相,測其吸光度值,計算得率。

1.5.2 提取功率對花椒果皮總生物堿得率的影響 準確稱取1g花椒果皮粉末(液固比20∶1),加入雙水相體系中于40℃恒溫水浴下超聲提取45min,提取功率分別為100、150、200、250、300W,過濾,濾液離心分相,測其吸光度值,計算得率。

1.5.3 液固比對花椒果皮總生物堿得率的影響 準確稱取1g花椒果皮粉末,液固比分別為5∶1,10∶1,15∶1,20∶1,25∶1,加入雙水相體系中于40℃恒溫水浴下分別超聲(200W)提取45min,過濾,濾液離心分相,測其吸光度值,計算得率。

1.6 生物堿的得率測定

按照響應面實驗表配制雙水相體系,稱取花椒果皮粉末10.00g置于雙水相體系中,于常溫下進行超聲提取。提取后將提取液置于分液漏斗中靜置分層,將上層正丙醇層置于圓底燒瓶中,減壓濃縮,得到粗提物浸膏。將所得粗提物浸膏用甲醇溶解,按照上述酸性染料比色法的方法,在415nm處測定各條件下樣品的吸光度值,并計算提取出的生物堿得率。

1.7 響應面分析實驗

根據Box-Benhnken中心組合設計的實驗原理,選擇提取功率、提取時間、液固比3個因素,進行3因素3水平共17個實驗點的響應面分析實驗,使用Design-expert software 8.05進行數據分析,求出數學模型,進而得到最佳的提取工藝條件,響應面實驗因素與水平編碼如表1。

1.8 比較研究

稱取花椒果皮粉末10.00g置于500mL圓底燒瓶中,按照1.7所得的最優工藝進行雙水相提取,獲得雙水相萃取物浸膏。

表1 響應面因素水平表Table 1 Independent variables and their actual values

稱取花椒果皮粉末10.00g置于250mL圓底燒瓶中,加100mL 95%乙醇回流提取2h,提取兩次,合并提取液,過濾,減壓濃縮,得到乙醇粗提物浸膏。

測定并比較雙水相萃取物浸膏和乙醇粗提物浸膏總生物堿的提取率和純度。

2 結果與分析

結果如圖1,顯示白鮮堿標準品在415nm處有最大吸收,故選定415nm為檢測波長。而在此波長下,用最大吸收光度值來確定酸性燃料用量、緩沖液pH、緩沖液用量,實驗結果分別是5mL、5、3mL。酸性染料比色法在測定總生物堿的過程中,隨著時間的延長,吸光度值不穩定,實驗發現在2h內,吸光度值是穩定的[15]。因此,在整個測定吸光度值的實驗過程中,需要控制其反應時間保持一致,且盡量控制在2h內測定吸光度。

圖1 白鮮堿全波長掃描圖譜Fig.1 The maximum absorption wavelength of dictamnine(200～800nm)

2.1 標準曲線的繪制

在415nm處測定不同濃度白鮮堿的吸光度,以白鮮堿標準溶液濃度(μg/mL不用標出)為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y)作圖,計算得出回歸方程:Y=0.2375X+0.4312,相關系數R2=0.9936。本方程在0.4～2.0μg/mL線性關系良好,可用于花椒果皮中生物堿含量的測定。

2.2 NPA/K2HPO4的質量分數的選擇

K2HPO4和NPA在一定的范圍內可組成雙水相,據此分別考察K2HPO4和NPA含量對總生物堿得率的影響。結果圖2所示,在考察NPA質量分數對總生物堿得率影響的單因素中,隨著NPA質量分數的增大,花椒總生物堿得率越高,在27%時達到最大值。當NPA質量分數超過27%時,體系中K2HPO4出現析出現象。所以NPA質量分數選擇為27%。

圖2 正丙醇濃度對總生物堿得率的影響Fig.2 Effects of the butanol concentration on the extraction rate of total alkaloid

在NPA質量分數固定為27%的條件下,選擇不同質量分數的K2HPO4組成的雙水相體系,考察K2HPO4質量分數對花椒果皮總生物堿得率的影響。結果如圖3,隨著K2HPO4質量分數的增大,花椒果皮總生物堿得率呈現先增大后減小的趨勢,19%時達到最大值。所以K2HPO4質量分數選擇為19%。

圖3 磷酸氫二鉀濃度對總生物堿得率的影響Fig.3 Effects of the K2HPO4 concentration on the extraction rate of total alkaloid

2.3 響應面分析實驗結果

根據單因素實驗結果,最佳的提取功率200W,提取時間45min,液固比20∶1。在響應面實驗中選取這3個因素作為自變量,以花椒果皮總生物堿得率為響應值。Box-Benhnken實驗設計與結果如表2所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Test results of significance for regression coefficient

注:*.p<0.05,差異顯著;**.p<0.01,差異極顯著。

2.4 顯著性檢驗

用軟件Design-Expert 8.05對所得數據進行回歸分析,分析結果如表3所示。對各因素進行多元回歸擬合和二項式擬合,得到花椒果皮總生物堿得率(Y)對三個因素(X)回歸方程:

Y=-29.83175+0.065665X1+0.83193X2+0.85172X3-2.00000×10-4X1X2+6.25000×10-4X1X3- 1.73333×10-3X2X3+6.39000×10-5X12- 8.16778×10-3X22- 0.021503 X32(R2=0.9889)

為檢驗方程的顯著性,對該模型回歸方程進行方差分析,結果如表3,模型p<0.0001,該模型極顯著,方程失擬誤差p>0.05,不顯著,說明該回歸模型與實際實驗擬合良好,證明應用響應面法優化的超聲輔助雙水相體系提取花椒果皮總生物堿是可行的。回歸方程各項的方差分析結果表明,X1,X22,X32,達到極顯著水平(p<0.01)。各因素對花椒果皮總生物堿得率的影響是:X1對花椒果皮總生物堿得率具有顯著影響,X2,X3對花椒果皮總生物堿得率有影響,但不顯著。

表2 響應面實驗設計表Table 2 Experimental design of response surface methodology

2.5 響應面及等高線分析

X1,X2,X3各因素對花椒果皮總生物堿純度影響的響應面和等高線圖,反映了兩兩因素之間的交互作用及對總生物堿得率的影響。等高線的形狀可反映交互作用的強弱,越趨于橢圓形表示兩因素交互作用越強,越趨于圓形則與之相反。用Design-Expert 8.05分析得到,提取功率(X1)和液固比(X3),提取時間(X2)和液固比(X3),提取功率(X1)和提取時間(X2)兩兩交互作用較弱。而響應面的極值點對應等高線橢圓中心點,結合響應面圖與等高線圖發現,提取功率(X1)對花椒果皮生物堿的純度有顯著影響。本文中各因素對花椒果皮總生物堿影響的響應面圖如圖4。

圖4 提取功率、提取時間和液固比 對花椒果皮總生物堿得率的影響Fig.4 The extraction power,extraction time and ratio of solvent the effect on the extraction rate of total alkaloid from the peel of Z. bungeanum

2.6 工藝條件驗證及提取法比較

通過軟件分析,求得預測的生物堿純度的最優工藝條件為:提取功率250W,提取時間45.59min,液固比21.6∶1,此時生物堿的得率最高,為19.28mg/g。

為檢驗其結果的可靠性,并考慮到實驗室儀器及條件的限制,將條件修正為提取功率250W,提取時間46min,液固比22∶1,按照此條件,在常溫下重復提取三次取平均值,結果如表4,生物堿得率平均值18.87mg/g,接近預測值,與預測值誤差為2.2%(<3%),表明該數學模型預測性較好。由此可見,雙水相法對生物堿的提取優于常規的乙醇回流法。

表4 兩種提取方法的比較研究Table 4 A comparative study between two extractions method

由結果可知,確定的最優提取工藝與響應面實驗中的最高值接近,且重復性較好,說明確定的工藝比較合理。

3 討論

雙水相萃取體系與傳統的有機溶劑萃取體系相比,它對于生物大分子物質具有活性損失小、操作條件溫和及有機溶劑殘留少等優點。而選取磷酸氫二鉀體系主要在于分相迅速,回收率高;過程集成,雙水相萃取既達到了純化的目的,又濃縮了料液。實驗結果表明正丙醇(27%),磷酸氫二鉀(19%)時,可獲得穩定的雙水相體系和較高的花椒果皮總生物堿得率。

確定了超聲波輔助雙水相提取花椒果皮總生物堿的最佳條件為:提取時間46min,超聲功率250W,液固比22∶1,此條件下總生物堿得率為18.87mg/g。

選擇了超聲波輔助雙水相體系提取花椒果皮總生物堿比傳統的回流提取方法得率提高了38.75%,純度提高了39.64%,既節約了提取時間,又減少了損失,比傳統的回流提取法有著更好的優勢和前景,對其開發利用具有一定指導意義。

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Aqueous two phase system coupled with ultrasound for the extraction of total alkaloid from the peel ofZanthoxylumbungeanum

ZHANG Bing-yun,WEI Jun-qing,GUO Tao*,HUANG Yan,WANG Ya,MA Jian-ping,WANG Ming-gang,ZHAO Ping,SUN Li,XIE Peng-yan,HE Lei

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Objective:In this study the use of an aqueous two phase system coupled with ultrasound for the extraction of total alkaloid from the peel ofZanthoxylumbungeanumwas evaluated and optimized using response surface methodology. Method:Using acidic dye colorimetry analysis methods and the ultrasonic coupling with propanol-potassium hydrogen phosphate aqueous two-phase system for extracting total alkaloid from the peel ofZ.bungeanumwas studied. The extraction of extraction time,extraction power and ratio of solvent to material were selected as response factors,the extraction rate of total alkaloid was selected as response value. According to Box-Benhnken design,three factors and three levels to optimize conditions on extraction ratio of total alkaloid were obtained. Result:The optimum extraction process of total alkaloid was:time of 46min,extraction power of 250W,solvent-material ratio of 22∶1 at which the highest extraction rate of total alkaloid was 18.87mg/g. The comparative study showed that average extraction rate and the average purity were 38.75% and 39.64% higher than the ethanol extraction method. Conclusion:Ultrasonic coupled with aqueous two-phase system extraction technology of total alkaloid from the peel ofZ.bungeanumhas the advantage of high extraction rate,high purity,and the method was reliable,and provided the basis for its further development.

Zanthoxylumbungeanum;aqueous two-phase system;alkaloid;acidic dye colorimetry analysis methods;ultrasound-assisted extraction

2014-03-27

張丙云(1968-)，女，碩士，副教授，主要從事食品保鮮研究。

*通訊作者:郭濤(1976-)，男，博士，研究方向：天然食藥資源的開發研究。

TS284.2

B

1002-0306(2015)01-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.033