徽州貢菊中熊果酸的高壓脈沖電場技術(HIPEF)輔助提取及純化工藝研究

孫克奎,金聲瑯,王 瑩

(1.黃山學院旅游學院,安徽黃山 245021;2.青島農業大學食品科學與工程學院,山東青島 266109)

徽州貢菊中熊果酸的高壓脈沖電場技術(HIPEF)輔助提取及純化工藝研究

孫克奎1,金聲瑯1,王 瑩2

(1.黃山學院旅游學院,安徽黃山 245021;2.青島農業大學食品科學與工程學院,山東青島 266109)

本文以徽州貢菊為原料,以熊果酸得率為指標,利用高壓脈沖電場技術(HIPEF)輔助提取徽州貢菊中熊果酸。最后確定的最佳提取參數是:電場強度30kV/cm、脈沖數2、料液比1∶12、溫度30℃,最終熊果酸的提取率可達97.577%;并確定了使用X-5大孔樹脂,上樣量60BV、pH11、吸附速率為2BV/h、洗脫劑用70%乙醇、2BV/h的洗脫速度純化效果最佳,最終徽州貢菊熊果酸的純度可以達到85%以上。

徽州貢菊,熊果酸,HIPEF輔助提取,純化

徽州貢菊(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.Gongju)名列全國四大名菊之首[1]。徽州貢菊富含菊甙、腺嘌吟、氨基酸、膽鹼、熊果酸、水蘇鹼、黃酮類及多種維生素[2-3]。其中熊果酸含量尤為豐富。熊果酸具有多種生物學活性,有抗病毒、抗腫瘤、降血脂和抗艾滋病等作用[4-5]。目前徽州貢菊已經實施原產地產品保護,推進無公害貢菊生產及品牌創建的產業化發展道路,由于市場上對貢菊的賣相十分看重,導致很多殘次的貢菊失去了市場,造成了浪費。顯然,單一的以茶用作為發展手段已不能滿足現代發展的需要,對其進行深加工以提高其附加值顯得刻不容緩。

本論文在前期研究的基礎上,引入高壓脈沖電場浸提技術,探討其對徽州貢菊熊果酸的浸提和純化工藝,以期提高徽州貢菊熊果酸的提取率,為進一步開發徽州貢菊的功能性產品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

徽州貢菊 黃山市歙縣采購;熊果酸對照品 安徽蕪湖甙爾塔醫藥科技有限公司,HPLC 98%;HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5大孔樹脂 南開大學化工廠;NaOH、H2SO4、乙醇 武漢宏大化學試劑廠,均為分析純;甲醇 天津科密歐化學試劑開發中心,色譜純。

Waters 600型高效液相色譜儀 Waters公司;CS501型恒溫水浴鍋 中國重慶銀河儀器有限公司;FA1204電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海振捷實驗設備有限公司;98-1-B型電子調溫電熱套 天津泰斯特儀器有限公司;XFB-500型高速中藥粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠;高壓脈沖電場(High Intensity Pulsed Electric Fields,HIPEF)系統裝置 自制[6],如圖1所示。

圖1 HIPEF處理系統Fig.1 Processing apparatus of high intensity pulsed electric field

1.2 熊果酸的提取

1.2.1 提取方法 徽州貢菊經清洗后粉碎,過80目篩,篩下物加入一定比例95%乙醇并混合,然后放入HIPEF處理系統的樣品容器中,用泵來抽取原料,使其在裝置中循環流動。

1.2.2 熊果酸的測定 采用高效液相色譜法,色譜條件:Phenomenex Luna C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-3%磷酸(88∶12),微濾膜過濾并超聲波脫氣20min;流速2.0mL/min;檢測波長210nm;進樣量10μL;色譜溫度為室溫。

計算熊果酸提取率的方法參考相關文獻[7],即提取率η(%)=浸出液中熊果酸的濃度(g/mL)×浸出液中熊果酸的體積(mL)/原料中熊果酸的質量(g)×100

1.2.3 HIPEF輔助提取的正交實驗 每次取100g經預處理的徽州貢菊進行最佳提取工藝實驗,根據多次預實驗及以往相關實驗經驗[8-9],以加入的電場強度、脈沖數、料液比、提取溫度作為考察因素,以熊果酸的提取量為評價指標,選擇L9(34)正交表進行最佳提取工藝實驗,實驗方案見表1。

表1 正交因素及水平表Table 1 The factors and levels of experiment

1.2.4 對比實驗 參考相關文獻[7]采用傳統的有機溶劑法浸提徽州貢菊中的熊果酸,并與HIPEF輔助提取法進行比較。

1.3 熊果酸的純化

1.3.1 大孔樹脂的篩選 取HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5這4種大孔樹脂進行實驗,分別加入徽州貢菊提取液40mL,在室溫下每5min振搖1次,24h后達到吸附平衡。測定這4種樹脂對徽州貢菊中熊果酸的吸附率。加40mL質量分數為70%的乙醇溶液對上述吸附飽和的大孔樹脂進行解吸,在室溫下每5min振搖1次,24h后測定各種樹脂對徽州貢菊熊果酸的解吸率。吸附率和解析率的計算方法參考相關文獻[10-11]。

1.3.2 pH的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉將提取液的pH分別調整成3、5、7、9、11,加于X-5大孔樹脂柱上,分別以2BV/h的流速吸附以及以5BV水洗脫,最后再由體積分數為70%的乙醇進行洗脫。

1.3.3 吸附速率的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調整為11,加于X-5大孔樹脂柱上,分別以1、2、3、4、5BV/h的流速進行吸附后,以5BV水洗脫,再用70%乙醇以2BV/h的速度洗脫,收集洗脫液測定熊果酸的濃度。

1.3.4 上樣量的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調整為11,加于20mL X-5大孔樹脂柱上,以2BV/h的流速進行吸附,按樹脂床體積數收集流出液,測定熊果酸的濃度。

1.3.5 乙醇洗脫濃度的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調整為11,加于X-5大孔樹脂柱上,以2BV/h的流速進行吸附,再以5BV水洗脫后,分別用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫,收集洗脫液,測定熊果酸的濃度。

1.3.6 洗脫速率的篩選 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調整為11,加于X-5大孔樹脂柱上,用70%乙醇洗脫,流速分別為1、2、3、4、5BV/h,收集洗脫液,測定熊果酸的濃度。

1.3.7 單因素實驗結果的驗證 取徽州貢菊提取液40mL,用1mol/L的氫氧化鈉將pH調整為11,加于X-5大孔樹脂柱上,按照上述最佳參數進行純化,并收集洗脫液,測定熊果酸的含量。然后水浴蒸干,于105℃干燥3h,測定干膏重,計算熊果酸的純度。

2 結果與分析

2.1 熊果酸提取結果與分析

2.1.1 熊果酸提取結果 采用1.2.2色譜條件,圖譜見圖2,以吸光度y為縱坐標,熊果酸濃度x為橫坐標,根據回歸方程:y=5146.3x-3214.8,R2=0.9953,按1.2.2中提取率公式計算出熊果酸的濃度。

圖2 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram chart注:A.對照品溶液,B.樣品+對照品溶液,C.供試品溶液。

2.1.2 正交實驗結果 對正交實驗結果進行方差分析,結果見表2和表3,綜合實驗結果可以得出,影響HIPEF輔助提取徽州貢菊中熊果酸的因素主次順序為料液比>電場強度>溫度>脈沖數。而且電場強度、料液比、溫度三因素有極顯著差異,脈沖數差異不顯著;結合表2和表3,得出最佳提取參數是A3B2C3D2,即電場強度30kV/cm、脈沖數4次、料液比1∶12、溫度30℃。

2.1.3 對比實驗 本文應用HIPEF法、有機溶劑提法分別提取徽州貢菊中的熊果酸,通過單因素實驗確定了各種方法的最優條件,即電場強度30kV/cm、脈沖數4次、料液比1∶12、溫度30℃,在最佳參數下最終熊果酸的提取率可達97.577%,與第七組實驗結果相同。由于第七組脈沖數更少,為減少能耗,則選用第七組的實驗參數為最后使用參數,即電場強度30kV/cm、脈沖數2次、料液比1∶12、溫度30℃。使用該方法遠遠高于傳統有機溶劑法得到的提取率82.748%。經重復該參數實驗驗證,也確實達到了該提取率。該方法能夠連續處理樣品,非常適合工業化生產。

表2 正交實驗分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

表3 熊果酸提取率的方差分析表Table 3 The ursolic acid content in anova table

注:*p<0.1,**p<0.05,***p<0.01。

2.2 熊果酸純化工藝結果與分析

2.2.1 大孔樹脂的確定 從表4中可以看出,HP2MG、HP2MGL、NKA-12、X-5這4種樹脂當中X-5大孔樹脂對徽州貢菊熊果酸的吸附和解析能力最好,所以選擇X-5大孔樹脂進行純化實驗。

表4 4種大孔樹脂對徽州貢菊熊果酸的吸附率與解析率Table 4 The adsorption rate and parse rate of huizhou gongju ursolic acid by 4 macroporous resin

2.2.2 pH考察結果 從表5中可以看出,當pH為11時,上柱后熊果酸的濃度達到了4.312mg/mL,解析率最高,因此選擇pH為11作為最佳參數。

表5 pH考察結果Table 5 The result of pH values

2.2.3 吸附速率對熊果酸的影響 從表6中可以看出,當吸附速率為1BV/h時,吸附效果最好,熊果酸濃度達到了4.420,解析率最高。但吸附速率為2BV/h的解析率與吸附速率與1BV/h的解析值相差不大,且速度快了一倍,所以選擇2BV/h吸附速率為最佳參數。

表6 吸附速率對熊果酸的影響Table 6 The result of the adsorption rate

2.2.4 上樣量對熊果酸的影響 從表7中可以看出,上樣量40BV為時開始泄漏,60BV時達到吸附最高值,故可選擇60BV上量。

表7 樣量對熊果酸的影響Table 7 The effect of the sample volume

2.2.5 不同乙醇濃度對熊果酸的影響 從表8中可以看出,當乙醇濃度從10%到70%,上柱后熊果酸的濃度逐步提高,乙醇濃度為90%時又開始降低,其中70%時洗脫效果最好,解析率達到90.454,因此選擇乙醇濃度70%為最佳參數。

表8 不同乙醇濃度對熊果酸的影響Table 8 The effect of the ethanol concentration

2.2.6 洗脫速率對熊果酸的影響 從表9可以看出,以1BV/h和2BV/h洗脫的解析率都很高,且相差很小,本實驗采用2BV/h的流速進行洗脫,以提高洗脫的效率。

表9 洗脫速率對熊果酸的影響Table 9 The effect of the rate of elution

2.2.7 驗證性實驗結果 從表10可以看出,在上樣液pH11、吸附速率為2BV/h,上樣量為60倍的床體積,選用體積分數為70%的乙醇溶液,2BV/h洗脫速率進行洗脫的工藝參數下,經X-5大孔樹脂柱處理后的熊果酸純度可達85%以上,且具有較好的重現性。

3 結論

應用高壓脈沖電場輔助提取技術,通過正交設計實驗考察了多種提取因素對徽州貢菊中提取熊果酸的影響,運用L9(34)正交設計表對電場強度、脈沖數、料液比、溫度等四種因素進行優化,得出最優的熊果酸提取條件為:電場強度30kV/cm、脈沖數2、料液比1∶12、溫度30℃,最終熊果酸的提取率可達97.577%,高于傳統有機溶劑法得到的提取率。

表10 熊果酸純度測定結果Table 10 The ursolic acid purity measurement results

利用大孔樹脂對徽州貢菊熊果酸進行富集純化實驗。通過對四種大孔樹脂對比實驗,得出X-5大孔樹脂為徽州貢菊熊果酸的理想吸附樹脂。其純化工藝參數為:上樣液pH11、吸附速率為2BV/h,上樣量為60倍的床體積,選用體積分數為70%的乙醇溶液,2BV/h洗脫速率進行洗脫。最終經X-5大孔樹脂處理后的徽州貢菊熊果酸的純度可以達到85%以上。

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High intensity pulsed electric fields(HIPEF)-assisted extraction and purification of ursolic acid from Huizhou Gongju

SUN Ke-kui1,JIN Sheng-lang1,WANG Ying2

(1.Tourism College,Huangshan University,Huangshan 245021,China;2.School of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The effects of the HIPEF-assisted extraction of ursolic acid from Huizhou Gongju were preliminary investigated,in which the technical parameters were optimized. The optimal conditions were as follows:electric field intensity of 30 kV/cm,pulse number of 2,material-solvent ratio of 1∶12 and 30℃. Under these conditions,the extraction yield of ursolic acid can reach to 97.577%. The results showed that the X-5 macroporons resin had the best effect on the separation when the volume of drug 60BV with the adsorption-speed 2BV/h,pH11,and the volume of 70% ethanol with desorption-speed 2BV/h,and the purity of ursolic acid could reach to 85%.

huizhou gongju;ursolic acid;HIPEF-assisted extraction;purification

2014-02-17

孫克奎(1978-)，男，碩士，講師，主要從事農產品加工及設備研究方面的研究。

2014年度安徽省教育廳自然科學研究重點項目(KJ2014A243)；2013年度安徽省高校重點研究基地招標項目(SK2013B484)。

TS255.5

B

1002-0306(2015)01-0207-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.034