響應面法優化微波法提取甘青青蘭總黃酮工藝

楊娟霞,董 偉,韓林磊,夏從芳,高云濤,葉艷青

(云南民族大學化學與生物技術學院,民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南昆明 650500)

響應面法優化微波法提取甘青青蘭總黃酮工藝

楊娟霞,董 偉,韓林磊,夏從芳,高云濤,葉艷青*

(云南民族大學化學與生物技術學院,民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室,云南昆明 650500)

目的:研究甘青青蘭總黃酮的最佳提取工藝。方法:以甘青青蘭為原料,比較振蕩提取法、超聲提取法以及微波提取法,得出微波法具有提取優勢。在單因素的基礎上,采用響應面法優化微波法提取總黃酮,分別選定微波時間、微波溫度、乙醇濃度和液料比四個水平進行響應面實驗,通過回歸分析得到優化組合條件。結果:甘青青蘭總黃酮微波提取最佳工藝條件為:微波時間7min,微波溫度59℃,乙醇濃度27%,液料比25∶1mL/g,此條件下總黃酮實際得率為29.68%,與模型預測得率29.65%的相對誤差為0.1%。結論:此優化方法可行,為甘青青蘭總黃酮的提取提供了參考數據。

甘青青蘭,總黃酮,響應面法,微波提取

唇形科青蘭屬的甘青青蘭(HerbaDracocephaliTangutici)是多年生蔓生草本[1],又稱唐古特青蘭,藏藥名知羊格[2],它分布于甘肅西南部、青海東部、四川西部和西藏東南部等地區,生于海拔1900～4600m的高山灌叢林地、松林邊緣、礫石草坡、干燥河谷兩岸,具有清熱祛濕、疏風解表、舒肝和胃、清肝熱胃熱、止血、干黃水等功能[3],近來許多研究表明甘青青蘭還具有抗缺氧、抗病毒、抑菌、止咳平喘等作用[4-7]。植物黃酮是一類低分子的天然活性成分,具有多種生物活性,如抗菌、抗氧化、鎮定、利尿、抗腫瘤等[8]。研究表明,甘青青蘭中含有多種黃酮類物質,如胡麻素、芹菜素、5,7,4′-三羥基-3′5′-二甲氧基黃酮,5,3′,4′-三羥基-6,7-二甲氧基黃酮等[9],其中已鑒定8個黃酮成分,分別是木犀草素和香葉木素的葡萄糖苷類[10]。植物化學成分分析顯示,甘青青蘭中黃酮類化合物含量高于其他多種傳統中藥[11]。

微波提取法應用于中藥有效成分的提取,具有節能、省時、操作簡便、得率高等優點,表現出良好的發展前景和巨大的應用潛力[12]。響應面法(RSM)以最經濟的方式,較少的實驗次數和較短的時間對所選的實驗參數進行全面研究,越來越多地應用于各種生物化工處理過程[13]。目前對于甘青青蘭中總黃酮提取工藝的研究未見報道,為了探究甘青青蘭中總黃酮提取的最佳工藝條件,本文以甘青青蘭中的總黃酮為研究對象,對提取方法進行了比較,結果顯示,微波提取法更有優勢。選定微波時間、微波溫度、乙醇濃度和液料比四個因素進行單因素實驗,在此基礎上,應用響應面法對甘青青蘭總黃酮的提取條件進行優化,利用回歸分析得到總黃酮的最優提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘青青蘭 購于迪慶藏族自治州藏醫院;蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所生產 含量為98%;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 均為分析純;實驗用水 均為超純水。

WFZUV-2000型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;EXCEL微波快速消解儀 上海屹堯儀器科技發展有限公司;AR224CN型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;101-型電熱鼓風干燥箱 上海儀器廠有限公司;WL-200高速中藥粉碎機 瑞安市威力制藥機械廠;EPED-20TH實驗超純水器 南京易普易達科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮的測定方法 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定總黃酮。取適量樣品液于25mL的容量瓶中,加30%乙醇10.00mL及5%的NaNO2溶液1.00mL搖勻,靜置6min,加10%的Al(NO3)3溶液1.00mL搖勻,靜置6min,加1mol/L的NaOH溶液10.00mL搖勻,加超純水稀釋至刻度,搖勻,靜置15min,以試劑為空白,在498nm處測定其吸光度值。

總黃酮得率(%)=提取液中總黃酮質量/物料質量×100

1.2.2 標準曲線繪制 準確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品0.05g(精確至0.0001g)溶解于60%乙醇中并定容至50mL,40℃水浴溶解,搖勻,制成1.0mg/mL的標準品溶液。分別取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60mL標準品溶液于9個25mL容量瓶中,用“1.2.1”的方法測得其吸光度,以樣品濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。得到的標準曲線方程為:A=0.0125C+0.005,R2=0.9999。

1.2.3 微波法提取總黃酮[14]準確稱取0.2g(精確至0.0001g)甘青青蘭于消解罐中,加入適量的一定濃度的乙醇后置于微波中按不同的條件萃取。再抽濾,定容為50mL。取1mL的樣品液于25mL的容量瓶中,用“1.2.1”的方法測得其吸光度。

1.2.4 振蕩法提取總黃酮[15]準確稱取0.2g(精確至0.0001g)甘青青蘭于試管中,按料液比1∶20加入30%乙醇,振蕩2h。再抽濾,定容為50mL。取1mL的樣品液于25mL的容量瓶中,用“1.2.1”的方法測得其吸光度。

1.2.5 超聲法提取總黃酮[16]準確稱取0.2g(精確至0.0001g)甘青青蘭于小燒杯中,按料液比1∶20加入30%乙醇,用保鮮膜封住燒杯口,超聲1h。再抽濾,定容為50mL。取1mL的樣品液于25mL的容量瓶中,用“1.2.1”的方法測得其吸光度。

1.2.6 單因素實驗的設置 選定微波溫度為60℃,乙醇濃度為60%,液料比為20∶1,考察微波時間對總黃酮得率的影響。選定微波時間為5min,乙醇濃度為30%,液料比為20∶1,考察微波溫度對總黃酮得率的影響。選定微波時間為5min,溫度為60℃,液料比20∶1,考察乙醇濃度對總黃酮得率的影響。選定微波時間為5min,溫度為60℃,乙醇濃度為60%,考察液料比對總黃酮得率的影響。

1.2.7 響應面法優化微波法提取甘青青蘭總黃酮工藝處理 選取微波時間、微波溫度、乙醇濃度和液料比作為響應面設計的4個因素,分別以X1、X2、X3和X4表示。在單因素實驗的基礎上,運用響應面分析法,對甘青青蘭總黃酮的提取過程進行優化,選擇最佳提取條件。

我守著毛毛的新墳，在山頂歇了四夜夕。我實在是太累了，頭也疼得很。渴了就下山到河邊喝點兒，餓了就啃兩口討來的米粑。那米粑被水泡過再曬干，硬得像鐵似的，我還是當個寶樣兒，生怕撒落了一星半點。夜深人靜的時候，有么事風吹草動我一點兒也不怕，反倒熱切地盼望有鬼就出來吧，你既然是靈是仙，那你告訴我，我的狼剩兒如今是在哪一方天？你告訴我，我的毛毛他轉世投生，是去了個好人家嗎？

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factor and levels of response surface experiments

1.3 數據統計分析

實驗所得數據采用Design Expert 8.05b軟件為輔助手段設計響應面實驗,選用Box-Behnken Design模型(BBD)進行回歸分析。通過對回歸模型方差及回歸模型各項方差的分析,檢驗回歸模型擬合度及其顯著性。根據回歸分析結果,做出響應面曲面圖,分析各實驗因素對微波提取甘青青蘭中總黃酮效果的影響。

2 結果與分析

2.1 總黃酮提取方法考察結果比較

振蕩提取、超聲提取和微波提取的得率分別為:25.40%、25.82%和29.34%,結果顯示,微波提取法效率最高,因此,選定微波提取法為樣品的提取方法。

2.2 單因素實驗結果與分析

2.2.1 微波時間對甘青青蘭總黃酮得率的影響 由圖1可知,當微波時間低于5min時,隨著微波時間的延長,總黃酮得率升高。當微波時間大于5min時,總黃酮得率隨時間的延長反而呈下降趨勢,這可能是由于微波時間過長導致黃酮破壞和分解的原因。因此選擇微波時間為5min。

圖1 微波時間對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 微波溫度對甘青青蘭總黃酮提取率的影響 由圖2可知,總黃酮得率隨著微波溫度的增加而增加,當溫度高于60℃時,黃酮含量反而呈下降的趨勢,這可能是由于提取溫度升高,雜質溶出物增多,吸附了黃酮的原因。因此選擇微波溫度為60℃。

圖2 微波溫度對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 乙醇濃度對甘青青蘭總黃酮得率的影響 由圖3可知，總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加而增加。當乙醇濃度大于30%時，總黃酮含量不再隨微波溫度增加而增加。原因可能是乙醇濃度不同，極性不同，對雜質溶出量和總黃酮提取量影響的原因，因此選擇乙醇濃度為30%。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

圖4 液料比對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid/material ratio on extraction yield of total flavonoids

2.3 響應面法提取條件的優化

在單因素實驗基礎上,使用Design Expert 8.05b軟件,設計了四因素三水平的響應面分析實驗,其方案與實驗結果見表2。響應面優化回歸方程的方差分析見表3。

表2 Box-Benhken中心組合設計方案及實驗結果Table 2 Results of response surface experiments

各因素經回歸擬合后得到回歸方程:Y1(%)=29.40+0.058X1+0.072X2+0.21X3+0.45X4+0.13X1X2-0.070X1X3+0.21X1X4+0.37X2X3-0.19X2X4-0.48X3X4-0.17X12-0.38X22-0.74X32-0.35X42。

由表3可知,所建立的回歸模型p<0.0001,達到極顯著水平,失擬項(p=0.1254)不顯著,并且決定系數R2=0.9434,說明回歸模型和預測值之間有較好的擬合度,自變量與響應值之間線性關系顯著,因此該模型可用于預測總黃酮得率Y的實際情況。

表3 響應面優化回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of optimal regression equation by response surface methodology

由表4可知,模型一次項X3和X4極顯著;交互項X2X3和X3X4極顯著;二次項X22、X32和X42極顯著,X12顯著。由此可知,自變量與響應值之間不是簡單的線性關系。從F值大小可以看出,各因素對總黃酮得率的影響程度依次是X4>X3>X2>X1,即液料比>乙醇濃度>微波溫度>微波時間。

表4 響應面分析優化后模型的系數檢驗Table 4 Coefficient test of optimal mode by response surface methodology

注:**表示極顯著(p<0.01),*表示顯著(0.01

根據回歸分析結果,做出響應面曲面圖5～圖7,由圖5可知,隨著液料比的增大總黃酮得率有明顯的變化趨勢,而隨著微波時間的延長總黃酮得率變化不太明顯,由等高線可看出,沿液料比向峰值移動,等高線密度高于沿微波時間移動的密度,表明微波時間對響應面貢獻更大。同理,得出單因素對總黃酮得率的影響程度依次是液料比(X4)>乙醇濃度(X3)>微波溫度(X2)>微波時間(X1),與F值大小比較得出的結果相符,由圖6和圖7可知X2X3和X3X4交互影響極顯著,結論進一步得到驗證。

圖5 液料比與微波時間 對總黃酮得率影響的響應面曲面圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of liquid/material ratio and microwave time on extraction yield of total flavonoids

圖6 乙醇濃度與微波溫度 對總黃酮得率影響的響應面曲面圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

圖7 乙醇濃度與液料比 對總黃酮得率影響的響應面曲面圖Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and liquid/material ratio on extraction yield of total flavonoids

根據得到的模型,使用點預測得到其最優工藝條件是微波時間7min,微波溫度58.97℃,乙醇濃度27.39%,液料比25∶1,在此條件下總黃酮得率理論值為29.65%。檢測實際結果與預測值是否相一致,考慮到實際操作的便利,將最佳工藝條件修正為微波時間7min,微波溫度59℃,乙醇濃度27%,液料比25∶1,在此條件下實際總黃酮得率平均值為29.68%,與模型預測得率29.65%的相對誤差為0.1%,即該模型可靠。

3 結論

本文的研究表明,相對另外兩種常用提取方法,微波法對甘青青蘭中總黃酮的提取更有優勢。通過響應面實驗設計,獲得最佳提取工藝條件為:微波時間7min,微波溫度59℃,乙醇濃度27%,液料比25∶1。該研究過程有效提高甘青青蘭中總黃酮的得率。由響應面實驗得到的模型可靠,說明該方法可行,可以預測各因素對得率的影響,為今后甘青青蘭中總黃酮的提取研究提供了一定的參考數據。

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Optimization of microwave extraction of flavones inHerbaDracocephaliTanguticiusing the response surface method

YANG Juan-xia,DONG Wei,HAN Lin-lei,XIA Cong-fang,GAO Yun-tao,YE Yan-qing*

(Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education,School of Chemistry and Biotechnology,Yunnan University of Nationalities,Kunming 650500,China)

Objective:To investigate the optimal extraction conditions of flavones fromHerbaDracocephaliTangutici. Methods:HerbaDracocephaliTanguticias the raw material. Flavones were extracted by different ways such as Oscillatio,ultrasonic and microwave,and the extraction effects were compared. The results indicated that microwave extraction had the advantage of higher efficiency. Four extraction parameters including microwave time,microwave temperature,ethanol concentration and liquid/material ratio were optimized using response surface methodology based on single factor experiments for achieving maximum flavones extraction rate. Results:Results showed that these optimal extraction conditions were as follows:microwave time of 7min,microwave temperature of 59℃,ethanol concentration of 27%,and liquid/material ratio of 25∶1mL/g. Under those conditions the actual yield rate of flavones was 29.68%,and the relative error between the predicted yield 29.65% was 0.1%. Conclusion:The results demonstrated that this method was feasible,and provided reference data for the extraction of flavones fromHerbaDracocephaliTangutici.

HerbaDracocephaliTangutici;flavones;response surface method;microwave extraction

2014-04-16

楊娟霞(1990-)，女，碩士，研究方向：分離分析科學。

*通訊作者:葉艷青(1967-)，女，碩士，教授，研究方向：分離分析和現代儀器分析化學。

國家自然科學基金項目(51062018)；國家民委科研項目(12YNZ006)；云南民族大學綠色化學與功能材料研究省創新團隊(2011HC008)；云南省高校綠色化學新能源與材料科技創新團隊(2011UY09)；云南民族大學化學與生物技術學院研究生創新項目(11HXYJSZ4)和本科創新項目(2011HX15)；云南民族大學化學與生物技術學院2013年大學生(碩士組)SRT創新性實驗項目(2013HXSRTY04)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)01-0216-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.036