大孔樹脂分離純化洛神花花色苷的研究

范碧琴,杜靜君,趙 桃

(上海工程技術大學化學化工學院,上海 201620)

大孔樹脂分離純化洛神花花色苷的研究

范碧琴,杜靜君,趙 桃*

(上海工程技術大學化學化工學院,上海 201620)

比較了NAK-9,X-5,AB-8,DM130,DA201,Sp850,XAD-7型大孔樹脂對洛神花花色苷的吸附純化效果,結果表明Sp850型大孔樹脂對洛神花花色苷具有較好的吸附和解吸能力,在25℃條件下的吸附特征符合Langmuir等溫吸附模型(R2=0.9961)。動態吸附和解吸研究表明,Sp850樹脂吸附純化洛神花花色苷的最佳參數為:上柱液溶液pH為2.0,上樣流速2BV/h,此條件下每克Sp850樹脂可處理14.3mg花色苷;洗脫劑為60%乙醇,解吸流速為2BV/h。可見光譜和HPLC分析可知純化前后花色苷性質未發生變化,純化后的洛神花花色苷純度增加7.4倍,由5.8%變為36.8%,回收率達到64.9%。

花色苷,大孔樹脂,洛神花,純化

花色苷是一類廣泛存在于植物的花、果實、莖、葉和根器官細胞液中的天然水溶性色素,使植物呈現由紅、紫紅到蘭等不同顏色。近年來研究發現,花色苷類色素不僅在不同溶劑條件下可呈現紅、綠、棕黃、藍紫等不同顏色,能滿足不同的著色需求[1],而且安全無毒,并具有較強的抗氧化[2-5],抗炎癥[6],抗癌[7-9]能力和顯著的心血管保護能力[10-11]。因此,花色苷在食品、化妝品、醫藥領域有著巨大應用潛力,是替代合成色素的理想材料。

洛神花(HibiscussabdariffaL.)是錦葵科木槿屬一年生植物,主要分布于我國臺灣、福建、廣東、廣西、云南等省區以及東半球熱帶地區。洛神花花萼中色素含量高,總花色苷含量為干花萼的2.5%(w/w)[12],且色素溶出快,是難得的天然紅色素資源,研究開發價值極大。

近幾年,天然植物活性成分的提取分離廣泛采用了大孔樹脂[13]。大孔樹脂的吸附作用主要是通過表面吸附、表面電性、氫鍵及分子篩作用等,具有應用范圍廣、理化性質穩定分離性能優良、使用方便、溶劑用量少等優點[14]。本研究主要對大孔樹脂分離純化洛神花花色苷的條件進行優化,確定最佳吸附樹脂類型和影響因素,旨在尋找具有一定選擇性、吸附容量大、易于解吸的樹脂及最佳純化工藝條件,為洛神花天然色素的開發和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洛神花 購自杭州藝福茶葉有限公司;實驗所用所有試劑 均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;NAK-9,X-5,AB-8,DM130,DA201,Sp850型大孔樹脂 購自北京慧德易科技有限公司;XAD-7型大孔樹脂 購自美國羅門哈斯公司。樹脂的基本特征如表1所示。

AB104-N型分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;pHS-2 pH計 上海分析儀器廠;UV-1800型紫外可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;RE52-99旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司;BT1-100恒流泵 上海琪特分析儀器有限公司;DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥機 上海賀德實驗設備有限公司;81-2電熱恒溫真空干燥機 上海醫療器械七廠;SXL-70冷凍水浴恒溫振蕩儀 金壇市佳美儀器有限公司。

表1 實驗所用大孔樹脂的基本性質Table1 Physical properties of the macroporous resins used

1.2 實驗方法

1.2.1 色素的提取 洛神花花萼磨碎過50目篩,以蒸餾水為溶劑,在料液比1∶6,50℃條件下水浴提取1h,在前期實驗基礎上，選擇將提取液過濾后置于4℃冰箱中避光保存。

1.2.2 色素濃度的測定 色素濃度的測定采用pH示差法[15],含量由等量矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cyd-3-G)表示,計算公式如下:

式(1)

式中:C為花色苷濃度(mg/L);A為pH 1.0時花色苷在520nm與700nm的吸光值之差減去pH4.5時花色苷在520nm與700nm的吸光值之差;MW為Cyd-3-G的分子量449.2g/mol;DF為稀釋倍數;103為將單位由g轉化為mg的倍數;ε為摩爾消光系數26900L/(mol·cm);1為比色皿寬度(cm)。

1.2.3 樹脂的預處理與再生 7種大孔樹脂,使用前先分別用四倍體積的無水乙醇浸泡24h,充分溶脹,去除懸浮顆粒。濕法裝柱,用無水乙醇淋洗直至洗出液無白色渾濁現象,再用蒸餾水洗至無乙醇為止,然后過濾收集樹脂。

大孔樹脂的再生方法:把用過的大孔樹脂濕法裝柱,以兩倍體積的5% NaOH浸泡10～24h,然后以蒸餾水洗至pH呈中性;再以兩倍體積的5% HCl浸泡4～6h,以蒸餾水洗至pH呈中性;再以兩倍體積的95%乙醇浸泡24h,最后用蒸餾水洗至流出液無乙醇為止。

1.2.4 樹脂水分含量的測定 稱取2g預處理后的樹脂,放入烘箱70℃下烘24～48h,至重量不再變化,稱重并計算樹脂的水分含量。本研究中所涉及的樹脂重量均記為換算后的干重質量。各樹脂的含水量見表1。

1.2.5 靜態吸附和解吸實驗 洛神花色素提取物的靜態吸附實驗方法為:將0.1g(干重)預處理后的樹脂置于50mL具塞磨口錐形瓶中,加入20mL花色苷提取液,恒溫振蕩器上于25℃、100r/min振蕩24h,充分吸附后,過濾,用pH示差法測定濾液的花色苷含量。

靜態解吸方法為:將濾出的樹脂用蒸餾水沖洗后,加入20mL乙醇溶液(80%)置恒溫振蕩器上于25℃、120r/min振蕩解吸24h,過濾,用pH示差法測定濾液的花色苷含量。

1.2.6 動態吸附和解吸實驗 樹脂的動態吸附和解吸實驗使用玻璃交換柱進行。將1.5g(干重)Sp850樹脂濕法裝柱,樹脂的柱體積(BV)為6mL。分別以1、2、3BV/h的流速上樣,上樣液濃度為22.0mg/L。每隔1BV測定流出液中花色苷的濃度,繪制泄露曲線。至流出液中花色苷的濃度增加為22.0mg/L,此時樹脂已達到吸附飽和。

上樣結束后用蒸餾水沖洗,以便洗下樹脂中水溶性的雜質、糖、蛋白質。待水洗流出液為無色后,用80%的乙醇溶液沖洗樹脂吸附柱,洗脫液分別以1、2、3BV/h的速度洗脫,收集洗脫液,每5mL測定一次流出液的花色苷含量,并繪制洗脫曲線。

1.2.7 樹脂吸附、解吸能力,吸附率和解吸率的計算 樹脂的吸附、解吸能力,吸附率和解吸率分別按照下列公式計算[16]。

吸附能力的測定:

式(2)

式(3)

式中:qe為吸附平衡時的吸附能力(mg/g樹脂);E為吸附率,即吸附平衡時吸收的花色苷與原液中花色苷含量的比值(%);C0和Ce為吸附前和吸附平衡后溶液中花色苷的濃度(mg/L);Vi為色素樣品的初體積(L);W為樹脂的干重(g)。

解吸能力的測定:

式(4)

式中,D為解吸率(%);Cd為吸解吸液中花色苷含量(mg/L);Vd為解吸液的體積(L);C0,Ce和Vi與式(2)(3)中相同。

1.2.8 吸附等溫線的測定 取不同初始濃度(7.7,15.4,30.9,61.9,123.8,247.5,495.0mg/L)的洛神花花色苷提取液各20mL,加入0.1g樹脂,在恒溫振蕩器上于25℃、100r/min振蕩24h,充分吸附后,測定樹脂吸附平衡后溶液中花色苷的濃度(mg/L),計算吸附能力qe(mg/g樹脂),繪制吸附等溫線。

1.2.9 回收率的測定 在實驗確定的最佳純化條件下(上樣pH2.0,上樣流速2BV/h,洗脫液40%乙醇,洗脫流速2BV/h),測定Sp850樹脂純化玫瑰茄花色苷的樣品的回收率,并按式(5)計算:

式(5)

式中,Y為回收率(%);C0為原液濃度(mg/L);Cd為洗脫液濃度(mg/L);Ca為流出液(即流出的上樣液)中花色苷濃度(mg/L);Vd為洗脫液體積(L);Vp為上樣液體積(L)。

1.2.10 富集效果測定 在最佳純化條件下,分析了Sp850樹脂對洛神花花色苷的純化效果。分別取10mL純化和未純化的洛神花提取液,測定其花色苷含量,然后在100℃條件下烘干提取液,測定其干物質(粉末)重量,并計算花色苷所占干重。

1.2.11HPLC檢測 分析所用色譜柱為WatersSunfireC18(2.1×150mm,5μm);流動相:A為0.1% 三氟乙酸,B為乙腈。線性梯度洗脫條件為[17]:0～5min,10%B;5～20min,10%～15%B;20～25min,15%B;25～30min,15%～18%B。流速:0.5mL/min,進樣量20μL,檢測波長520nm。

1.3 數據分析

所有實驗均設置3次重復,文中數據取重復實驗平均值。統計學分析采用SPSS11.5forWindows軟件進行。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

從表2可以看出,7種大孔樹脂吸附率大小為Sp850>DM130>AB-8>X-5>XAD-7>DA201>NKA-9。從樹脂極性來看,非極性和弱極性的樹脂,如Sp850、DM130、AB-8、X-5對花色苷類色素的吸附能力較強。從樹脂的比表面積來看,比表面積增加,吸附量提高。Sp850的吸附能力大于樹脂AB-8、DM130、X-5;XAD-7的吸附能力也大于DA201。這是由于大孔樹脂的吸附原理主要為物理吸附,產生的吸附只是分子間的引力,因此表面積增加分子間作用力加強,對吸附有利。供試7種大孔樹脂的解吸能力為:Sp850>DM130>AB-8>X-5>XAD-7>DA201>NKA-9,與其吸附能力一致。

表2 不同樹脂的吸附和解吸性能Table 2 Results of adsorption capacities,adsorptionand desorption ratios of different resins

由于花色苷類物質在溶液中的結構受pH影響顯著,選擇了吸附和解吸效果最好的Sp850,DM130,AB-8三種樹脂,考察不同pH下它們對洛神花色素的吸附效果,以便進一步篩選合適的樹脂,實驗結果如圖1所示。由圖可知,Sp850、DM130、AB-8在各自最佳pH下的吸附能力為Sp850>AB-8>DM130。Sp850在pH為2.0時吸附效果最佳。在不同pH的水溶液中,花色苷存在不同分子結構的平衡。在pH為1.0時主要以花鎓陽離子結構存在,在pH為2.0左右在溶液中保持分子形式,隨著pH的進一步增加,花色苷分子逐步發生去質子化,并最終開環形成醌式脫水堿和查爾酮混合物[18]。因此,洛神花花色苷在pH2.0～3.0時的吸附量最大,說明實驗所用三種樹脂對花色苷類物質的吸附主要依靠氫鍵。由于Sp850樹脂對洛神花花色苷具有最佳靜態吸附和解吸能力,故用于進行隨后的深入研究。

圖1 樣品pH對樹脂吸附能力的影響Fig.1 Effect of pH value of sample solution on the adsorption capacities of resins

2.2 樹脂的吸附飽和曲線

通過測定溶液中殘留的花色苷濃度研究Sp850 樹脂對洛神花花色苷的靜態吸附動力曲線。由圖2可知,在最初的1.5h,Sp850對洛神花花色苷的吸附速率迅速上升,隨后逐漸下降,并在5h左右到平衡,因此Sp850的靜態吸附飽和時間為5h。

圖2 Sp850吸附洛神花花色苷的動力曲線Fig.2 Adsorption kinetics curve for roselle anthocyanins on Sp850

2.3 吸附等溫線

在25℃條件下Sp850對洛神花花色苷的吸附等溫線如圖3所示。洛神花花色苷的溶液的初始濃度分別為7.7,15.4,30.9,61.9,123.8,247.5,495.0mg/L。如圖3所示,Sp850對洛神花花色苷的吸附量隨初始溶液濃度上升,至247.5mg/L達到飽和。

圖3 25℃條件下Sp850吸附洛神花花色苷的動力曲線Fig.3 Adsorption isotherm for roselle anthocyanins on Sp850 at 25℃

采用Langmuir和 Freundlich模型研究花色苷與樹脂之間的相互作用。其中,Langmuir模型適用于研究單層吸附,假定吸附能量均一地分配,吸附劑和吸附質之間沒有相互作用,而Freundlich模型假定在不同的吸附位置和能量下存在非均一的吸附,被廣泛用于不同的吸附體系,可研究單層以及多層吸附行為。

實驗數據用Langmuir方程式(6)進行擬合:

式(6)

其中K為吸附平衡常數;q0為經驗常數;qe,Ce同式(2)。

根據Ce和Ce/qe繪制線性曲線,分別從截距和斜率得到K和q0值。

實驗數據同時采用Freundlich方程(7)進行擬合:

式(7)

其中:K為Freundlich常數,可用于判定吸附能力;n為經驗常數,與吸附力的數量級相關[19],Ce同式(2)。

式(7)可轉化為線性公式(8):

lnqe=lnK+nlnCe

式(8)

根據lnCe和lnqe繪制線性回歸曲線,分別從截距和斜率得到K和n值。

如表3所示,Langmuir和Freundlich模型對實驗數據進行擬合的相關系數R2均達0.9以上,其中Langmuir的相關系數R2最高,達到0.9961,說明此模型更適用于研究Sp850樹脂對洛神花花色苷的吸附。一般認為當Freundlich方程中n的值在0.1～0.5范圍內時吸附較易進行,當n在0.5～1范圍內時吸附較難發生,該值超過1時,很難進行吸附[20]。從表3中可知,Sp850樹脂吸附洛神花花色苷時的n值為0.3477,即25℃時該吸附反應較易進行。

表3 25℃條件下Sp850吸附洛神花花色苷的吸附等溫參數Table 3 Langmuir and Freundlich adsorption isothermparameters for roselle anthocyanins on Sp850 at 25℃

2.4 洗脫液對靜態解吸的影響

樹脂的靜態解吸實驗按照1.2.5中的方法進行。樹脂吸附平衡以后,用蒸餾水洗凈樹脂表面的雜質,過濾。將濾出的樹脂加入20mL不同濃度(0%,20%,40%,60%,80%,95%)的酸化乙醇(含0.1% HCl)溶液進行解吸,所得結果如圖4所示,使用40%～60%左右的酸化乙醇即可達到>90%以上的洗脫率,但根據隨后對色素動態洗脫曲線的測定,發現在相同的流速條件下,使用60%的乙醇洗脫速度更快,且洗脫成分相對集中,有利于純化和富集(結果另文發表),故確定最佳靜態解吸乙醇濃度為60%。

圖4 乙醇濃度對靜態洗脫率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the static desorption ratio

2.5 樹脂動態泄露曲線的測定

大孔樹脂的吸附達到泄漏點時,樹脂的吸附力減弱甚至消失,溶質會從樹脂中泄漏出來。因此在樹脂純化過程中,通過泄漏曲線來確定所需樹脂的量,上樣體積和合適的上樣流速是非常必要的[16]。一般認為當流出液的濃度達到上樣液濃度的10%時,樹脂的吸附量已經達到飽和,此時的上樣體積為最佳上樣體積。

在不同的上樣流速條件下檢測了Sp850大孔樹脂的動態泄露曲線,每6mL檢測一次流出液中的花色苷含量。由圖5可知,在相同濃度下,以1BV/h為流速時,最佳上樣體積為168mL;當流速為2BV/h時,最佳上樣體積為162mL;當流速為3BV/h時,最佳上樣體積為120mL。由此可得,在1、2BV/h流速下,最佳上樣體積相近,而2BV/h流速時更節約時間,效率更高,故最佳上樣流速為2BV/h。在此流速條件下,6mL(1.5g干重)濕樹脂可以處理162mL濃度為132.6mg/L洛神花花色苷提取液,即每克樹脂可純化14.3mg花色苷,可見采用Sp850樹脂純化洛神花花色苷是一個高效經濟的方法。

圖5 不同流速條件下Sp850樹脂 吸附洛神花花色苷的動態泄露曲線Fig.5 Dynamic breakthrough curves of roselle anthocyanins packed with Sp850 resin at different flow rates

2.6 動態洗脫曲線

為了選擇最佳的洗脫流速,對1、2、3BV/h三種流速進行了測定。由圖6可知,流速較慢時(1BV/h)出峰時間較慢,導致整個制備周期的延長。在流速提高至2BV/h和3BV/h時,出峰時間相似,但2BV/h的解吸曲線對稱性更好,洗脫成分相對集中,有利于純化和富集。因此在2BV/h流速條件下,從Sp850樹脂解吸洛神花花色苷效果更好。

圖6 不同流速條件下Sp850樹脂 吸附洛神花花色苷的動態洗脫曲線Fig.6 Dynamic desorption curves of roselle anthocyanins packed with Sp850 resin at different flow rates

2.7 純化效果分析

2.7.1 回收率 根據實驗結果計算可知,在最佳純化條件下,利用Sp850樹脂純化玫瑰茄花色苷的回收率Y達64.9%。

2.7.2 富集效果 由表4可知,純化前花色苷的百分含量為5.8%,純化后的花色苷的百分含量為36.8%,花色苷富集倍數為7.4。

表4 純化前后洛神花提取物中花色苷的百分含量Table 4 Anthocyanins in raw roselle extract before and after purification with Sp850

2.7.3 純化工藝對洛神花花色苷性質的影響 為考察純化工藝對洛神花花色苷性質是否有影響,在可見光區400～800nm對其進行了全波長掃描和HPLC分析。全波長掃描結果發現,純化后花色苷的波形及其最大吸收波長λmax沒有發生改變,均位于花色苷類物質的最大可見吸收波長518nm(圖7)。

圖7 純化前后洛神花提取物的可見吸收光譜Fig.7 Absorption spectra of roselle extract before and after purification

洛神花色素提取液的HPLC分析結果如圖8所示。由文獻可知,洛神花中主要含有飛燕草素-3-和矢車菊-3-桑布雙糖苷[21],分別對應為圖中的兩個主要吸收峰。純化前后兩個吸收峰的出峰時間和峰型沒有發生改變。由光譜分析和HPLC結果,可以推測采用Sp850樹脂純化過程,未對花色苷的組成產生明顯影響。

圖8 純化前后洛神花提取物的HPLC圖譜Fig.8 HPLC spectra of roselle extract before and after purification

3 結論

本研究對7種不同性質的大孔樹脂對洛神花花色苷的吸附解吸能力進行了測定,結果發現Sp850樹脂具有較好的吸附和解吸能力。在25℃條件下,吸附數據對Langmuir和Freundlich模型都擬合良好。實驗確定的分離純化最佳條件為:上柱液溶液pH為2.0,上樣流速2BV/h,此條件下每克Sp850樹脂可處理14.3mg花色苷;洗脫劑為60%乙醇,解吸流速為2BV/h。可見光譜和HPLC分析可知純化前后花色苷性質未發生變化,純化后的洛神花花色苷純度增加7.4倍,由5.8%變為36.8%,回收率達到64.9%。研究結果表明了Sp850大孔樹脂對洛神花花色苷進行純化的工藝是經濟有效的,為洛神花色素工業化生產提供了理論基礎。

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Separation of anthocyanins from roselle by macroporous resins

FAN Bi-qin,DU Jing-jun,ZHAO Tao*

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanghai University of Engineering Sciences,Shanghai 201620,China)

The absorption and desorption properties of total roselle anthocyanins on macroporous resins including NAK-9,X-5,AB-8,DM130,DA201,Sp850 and XAD-7 were compared. According to the results,Sp850 resin offered better absorption and desorption capacity for roselle anthocyanins than other resins,and its adsorption data at 25℃ fit the best to the Langmuir isotherm. Dynamic adsorption and desorption experiments were carried out on the Sp850 resin packed column to optimize the separation process of anthocyanins from roselle extracts. The optimum parameters for adsorption were as follows:sample pH2.0,flow rate 2BV/h,14.3mg anthocyanin/g resin;for desorption were:elution solvent 60% ethanol and flow rate 2BV/h. Based on the visible spectrum and HPLC results,the anthocyanin compositions didn’t change through the separation process. After be treated with Sp850 resin,the anthocyanins content in the product was increased 7.4-fold from 5.8% to 36.8%,with a recovery yield of 64.9%.

anthocyanins;macroporous resin;roselle;purification

2014-04-03

范碧琴(1992-),女,本科,研究方向:制藥工程。

*通訊作者:趙桃(1982-),女,博士,副教授,研究方向:天然產物。

上海工程技術大學高水平項目培育基金(2012gp10);上海工程技術大學大學生創新活動計劃(cs1104018);上海市大學生創新活動計劃(cs1204011);國家大學生創新活動計劃(cx1204012)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)01-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.037