銀葉樹種子蛋白的提取及其功能性研究

熊 拯,鐘秋平,李麗清

(欽州學院 海洋學院,廣西欽州 535099)

銀葉樹種子蛋白的提取及其功能性研究

熊 拯,鐘秋平,李麗清

(欽州學院 海洋學院,廣西欽州 535099)

以銀葉樹種子為原料,考察提取工藝對其蛋白提取率的影響。通過單因素實驗對影響銀葉樹種子蛋白提取率的pH、提取時間、液料比和提取溫度等四個因素進行研究,并采用Box-Behnken實驗設計和響應曲面分析法確定銀葉樹種子蛋白提取的最佳工藝條件。結果表明:最佳提取工藝條件為提取溫度55℃、pH10、提取時間2h、液料比11∶1,在此條件下蛋白提取率為50.85%;銀葉樹種子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫穩定性優于大豆分離蛋白;而大豆分離蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫穩定性優于銀葉樹種子蛋白。

響應曲面,銀葉樹種子,蛋白質,提取

銀葉樹(Heritieralittoralis)是銀葉樹屬紅樹植物,也稱大白葉仔,為梧桐科銀葉樹屬真紅樹植物,廣泛分布于熱帶海岸,在我國海南、廣東、廣西和臺灣等地均有分布[1]。果實內僅含一粒種子,為其主要藥用部位,種子無胚乳,主要由兩片肥厚的子葉構成[2],銀葉樹種子主治腹瀉、痢疾[3],其種仁被作為一種滋補品,有一定的食用價值[4]。

目前,國內外學者關于銀葉樹的研究主要集中于通過溶劑萃取、大孔吸附樹脂柱層析、硅膠柱層析、Sephadex LH.20柱層析、HPLC等方法從該植物的根、莖、葉中分離鑒定化合物[5-7],但是從食品研究開發的角度對銀葉樹進行的研究非常少。本研究擬采用堿溶酸沉法[8-10]對銀葉樹種子中的蛋白質進行提取,通過單因素實驗考察pH、提取溫度、提取時間和液料比四個因素對提取率的影響,并采用響應曲面法對銀葉樹種子蛋白質的提取條件進行優化,以期為銀葉樹種子系列食品的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀葉樹種子,采自防城港銀葉樹生態保護區;石油醚,分析純,成都科龍化工試劑廠;硫酸鉀、硫酸銅和硼酸,分析純,廣東光華化學廠有限公司;硫酸、鹽酸和甲基紅,分析純,成都科龍化工試劑廠;溴甲酚綠、醋酸和醋酸鈉,分析純,天津市光復精細化工研究所。

80-1型電動離心機 上海梅香儀器有限公司;FA2004型電子分析天平 上海耀杰有限公司;PHS-3CF型精密酸度計,上海大普儀器有限公司;101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海東星建材實驗設備有限公司;自動凱氏定氮儀 國藥集團化學試劑有限公司;FW-100型高速萬能粉碎機 上海勝啟儀器儀表有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;SHB-IIIA型循環水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀葉樹種子脫脂 銀葉樹果實去殼后,在溫度50℃下的烘箱里烘干至恒重,粉碎,過40目篩,按照10∶1(V/W,以下同)的液料比用石油醚脫脂,置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2 銀葉樹種子蛋白等電點的測定 稱取10g樣品,液料比為10∶1,pH調至10。在溫度30℃下磁力攪拌浸提1.0h,離心(4000r/min,20min)取上清液,分取上清液8份各20mL,用醋酸和醋酸鈉緩沖溶液分別調pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0,離心(4000r/min,20min),出現沉淀量最大時的緩沖溶液pH為銀葉樹種子蛋白質的等電點。實驗中出現沉淀量最大時的緩沖溶液pH為3.5。

1.2.3 銀葉樹種子蛋白的提取工藝流程 銀葉樹果實→去殼→干燥→粉碎(過40目篩)→脫脂→攪拌浸提→離心分離(4000r/min,10min)→取上清液→調蛋白等電點→離心分離(4000r/min,20min)→沉淀→干燥→粗蛋白[11]

其中,蛋白質提取率計算如下:

蛋白質提取率(%)=(產品質量×產品中蛋白質的百分含量/樣品質量×樣品中蛋白質的百分含量)×100

其中,樣品為粉碎后的銀葉樹種子;產品為所提取的蛋白質;蛋白提取液和產品中的蛋白質含量用微量凱氏定氮法測定。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 提取溫度的影響 固定pH為10.0,提取時間為1.0h,液料比為10∶1,提取溫度設定25、35、45、55、65℃五個水平梯度,考察提取溫度對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.4.2 pH的影響 固定提取溫度為55℃,提取時間為1.0h,液料比為10∶1,pH設定8.0、9.0、10.0、11.0和12.0五個水平梯度,考察pH對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.4.3 提取時間的影響 固定提取溫度為55℃,pH為10.0,液料比為50∶1,提取時間設定1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h五個水平梯度,考察提取時間對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.4.4 液料比的影響 固定提取溫度為55℃,pH為10.0,提取時間為2.0h,液料比設定5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1五個水平梯度,考察液料比對銀葉樹種子蛋白提取率的影響。每個實驗點做三次重復。

1.2.5 響應曲面實驗設計 應用Design Expert 軟件,根據Box-Behnken 中心組合設計原理,在單因素實驗結果的基礎上,綜合考慮實際生產的需要,以銀葉樹種子為原材料,堿溶pH為X1,提取時間為X2,提取溫度為X3,液料比為X4,蛋白提取率Y為響應值,進行響應曲面實驗設計,因素水平見表1。在實驗設計中,每個實驗點重復3 次,結果取平均值。數據分析主要采用散點圖、相關分析和回歸分析等方法進行。

表1 實驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of the experiments

1.2.6 銀葉樹種子蛋白功能特性評價方法 本文分別參照相應的參考文獻對銀葉樹種子蛋白的吸水性、吸油性、乳化性、乳化穩定性、起泡性及泡沫穩定性功能性進行評價分析[11-12]。

2 結果與分析

2.1 單因素對銀葉樹種子蛋白提取率的影響

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可知,銀葉樹種子蛋白的提取率隨著溫度的升高而增加,溫度55℃時達到最高值;而提取溫度超過55℃,提取率呈現逐漸降低的趨勢。因為蛋白質溶解時必須破壞蛋白質之間的相互作用,而加熱使蛋白質分子間和分子內的二硫鍵斷裂,亞基伸展,疏水基暴露,使蛋白質的氮溶解指數升高[13];但在溫度高于55℃時,隨著溫度的升高,蛋白質開始變性,蛋白質的氮溶解指數降低。因此,溫度選擇在55℃較為適宜。

圖1 提取溫度對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.2 pH的影響 由圖2可知,在pH10時,蛋白質的提取率最好,降低或增加pH均有使蛋白質提取率降低的趨勢。可能是由于堿液對蛋白質體系的平衡和多肽鏈中某些側鏈基團的解離程度發生變化的結果。因此,選擇pH較為10適宜。

圖2 pH對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.3 提取時間的影響 由圖3可知,蛋白質的提取率隨著提取時間的延長呈現先增大后減小的趨勢。這是由于隨著提取時間的延長,溶液中的蛋白質出現凝聚沉淀,離心時蛋白質和殘渣一同被排除,從而降低了蛋白質的提取率[14-15]。因此,提取時間選擇2h較為適宜。

圖3 提取時間對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.4 液料比的影響 由圖4可知:當液料比為10∶1時,蛋白質的提取率最高。在液料比由5∶1上升到10∶1,隨著液料比的增加,蛋白質的提取率也升高。液料比達到10∶1后繼續增加,蛋白質的提取率反而降低了。因此,液料比選擇10∶1較為適宜。

圖4 液料比對銀葉樹種子蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.2 提取條件的優化

2.2.1 結果回歸分析 由單因素實驗可知,不同因素對蛋白提取率的影響程度不同,故以pH、提取時間、液料比和提取溫度四個因素為可控工藝參數,以提取率為實驗指標,采用Box-Behnken設計方法來優化銀葉樹種子蛋白提取工藝條件,實驗設計方案及結果見表2。

利用Design Expert軟件,通過表3中實驗數據進行多元回歸擬合,獲得銀葉樹種子蛋白質提取率對編碼自變量pH、提取時間、液料比和提取溫度的二次多項回歸方程:

Y=52.83+0.61X1+0.21X2+0.49X3-0.37X4+0.68X1X2+0.47X1X3+0.35X1X4-0.1X2X3-0.24X2X4-0.077X3X4-3.31X12-1.29X22-1.24X32-1.62X42

回歸方程中各變量對蛋白質提取率影響的顯著性由F檢驗來判定;概率p越小則相應變量的顯著性越高[16]。對上述回歸模型進行方差分析(表3),結果表明,回歸方程極顯著,相關系數的平方即R2=97.20%,說明響應值(提取率)的變化有97.20%來源于所選變量,即浸提溫度,浸提時間和料液比。因此,回歸方程擬合度良好,可利用該方程代替真實實驗點進行分析。由P值可知,方程的X1、X3、X1X2、X12、X22、X32和X42對Y值影響極顯著,X4、X1X3對Y值影響顯著,表明該方程并非簡單的線性關系,交互作用對響應值影響很大,方程二次項對響應值影響也很大。失擬項p=0.1890,無顯著性影響,表明數據沒有異常點,不需要分析更高次數的項,模型適當。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 響應面分析及蛋白質提取條件的優化 通過響應曲面圖可以直觀地反映實驗條件對蛋白質提取效果的影響。由圖5可知,提取率隨著溫度的升高而增加,而提取溫度超過50℃,提取率呈現逐漸降低的趨勢;提取率隨著pH的升高而增加,而pH超過10時,呈現逐漸降低的趨勢;提取率提取率隨著提取時間的增長而顯著增加,而提取時間超過2h,提取率反而有下降的趨勢;蛋白質的提取率隨著液料比的增加而增加,而液料比超過10∶1,蛋白質的提取率反而降低了。這與單因素實驗的結果趨勢相同。

表3 回歸模型方程的方差分析Table 3 Analysing variance of regression model

圖5 各因素交互作用對銀葉樹種子蛋白提取率影響的響應曲面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the extraction yield of Heritiera littoralis seed protein

注:Pr值是方差齊性檢查的結果;**表示極顯著水平(p<0.01);*表示顯著水平(p<0.05)。

為了進一步求得各因素的最佳條件組合,對回歸方程進行數學處理,偏導求零后的極值方程組求解,得到銀葉樹種子蛋白提取的優化條件為:堿溶pH10.11,時間2.055 h,液料比11.05∶1,溫度56.1℃,此時所得蛋白提取率為52.95%。采取上述最優條件進行實驗,同時考慮到實際操作的情況,將銀葉樹種子蛋白質提取條件修正為提取溫度55℃、pH10、提取時間2h、液料比11∶1,粗蛋白質量分數為88.53%;實測提取率為50.85%,說明采用響應面分析法優化得到的實驗參數是可靠的。

2.2.3 銀葉樹種子蛋白與大豆分離蛋白的功能性質比較 實驗將銀葉樹種子蛋白與大豆分離蛋白的幾種功能性質進行了比較研究[11],實驗結果見表4。結果表明,銀葉樹種子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫穩定性優于大豆分離蛋白;而大豆分離蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫穩定性優于銀葉樹種子蛋白。

表4 銀葉樹種子蛋白和大豆分離蛋白的功能性比較Table 4 Comparing on functionality of Camellia oleifera seed protein and SPI

3 結論

通過單因素實驗和Box-Behnken實驗設計以及響應面分析對銀葉樹種子蛋白提取工藝進行了優化,各因素對提取率的影響大小為:堿溶pH>提取溫度>液料比>提取時間。結合實際操作,確定提取銀葉樹種子蛋白質的最優條件是:提取溫度55℃、pH10、提取時間2h、液料比11∶1,提取率為50.85%。銀葉樹種子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫穩定性優于大豆分離蛋白;而大豆分離蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫穩定性優于銀葉樹種子蛋白。

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Study on the extraction and function of Heritiera littoralis seed protein

XIONG Zheng,ZHONG Qiu-ping,LI Li-qing

(School of Ocean,Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

The effect of process on extraction rate of Heritiera littoralis seed protein was discussed in this study. The factors of pH,temperature,time,and liquid/solid ratio were studied by single factor experiments,and Box-Behnken design and response surface methodology were applied to confirm the optimum experiment condition. The highest protein extraction rate was 50.85% under the condition:temperature(55℃),pH10,extraction time 2h,liquid/solid ratio 11∶1. The water retention capability,foaming properties and foaming stability of Heritiera littoralis seed protein were better than SPI;the oil-absorbing,emulsifying capacity,and emulsifying stability of SPI were better than Heritiera littoralis seed protein’s.

response surface methodology(RSM);Heritiera littoralis seed;protein;extraction

2014-02-10

熊拯(1981-)，男，碩士，副教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

廣西高校科學技術研究項目(2013YB260)。

TS202.1

B

1002-0306(2015)01-0239-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.041