殼聚糖對魚腥草提取液絮凝除雜效果的研究

李思東,陳 松,何 明,楊錫洪,*,劉莉莉,莊巧玲

(1. 廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2. 海南大學材料與化工學院,海南海口 570228;3. 廣東海洋大學理學院,廣東湛江 524088)

殼聚糖對魚腥草提取液絮凝除雜效果的研究

李思東1,陳 松1,何 明2,楊錫洪1,*,劉莉莉1,莊巧玲3

(1. 廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088;2. 海南大學材料與化工學院,海南海口 570228;3. 廣東海洋大學理學院,廣東湛江 524088)

研究了殼聚糖用量、pH和溫度對魚腥草提取液絮凝除雜效果的影響,并對其工藝進行了正交實驗優化。實驗結果表明最佳的工藝條件是殼聚糖用量為0.04g/100mL,提取液pH為6.0,溫度為30℃;在此條件下,魚腥草澄清液的黃酮保留率為80.0%,透光率高達68.1%。該工藝在絮凝除雜的同時又較好地保留了魚腥草有效成分,具有良好的應用前景。

殼聚糖,魚腥草提取液,絮凝,黃酮

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物,是一種傳統藥用植物,分布在長江流域以南地區[1-2]。魚腥草含有多種化學成分,主要活性成分為揮發油和黃酮類化合物[3-4]。已有研究表明魚腥草中的黃酮類化合物具有抗疲勞[5]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8]等功能。魚腥草中的黃酮類物質主要包括槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、瑞諾苷、金絲桃苷、阿芙苷和蘆丁等[9],蘆丁常被用作測定和評價魚腥草中的黃酮含量的指標[10-11]。

藥用植物提取液是加工生產功能性食品的主要原料,但因其成分復雜,含有蛋白質、多糖、鞣質、樹膠、色素、淀粉等,是非常混濁的膠體分散體系,需要進行澄清處理[12]。上世紀50年代后期至今,水提醇沉法被普遍采用,但醇沉法存在諸多不足,如乙醇耗量大、操作麻煩、成本高、工藝流程長,會除去具有降血糖、抗癌等功效的活性多糖,得到的制劑易產生沉淀或黏膜現象,使提取液的保健功能降低[13]。

近年來,大量天然高分子絮凝劑被用作藥用植物提取液的澄清,如明膠、101果汁澄清、ZTC系列澄清劑及殼聚糖等[14-18]。殼聚糖以其成本低廉、具有生物降解性和良好的生物相容性、安全無毒,既能除去雜質,保證藥液或制劑穩定,又能保留有效成分,縮短生產周期等優點,被廣泛應用于藥用植物提取液及其制劑的澄清精制[19]。本文以魚腥草為原料,對殼聚糖絮凝除雜魚腥草提取液的工藝進行研究,以期確定最佳工藝條件,為工業化生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草 購自湛江益生藥店;400ku分子量殼聚糖 湛江廉江市臺興生物科技有限公司;蘆丁標準品 上海友思生物技術有限公司;其它試劑均為分析純。

UV-5500型紫外可見分光光度計 上海分析儀器有限公司;RE52CS型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪京華儀器廠;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;PHS-25型實驗室pH計 上海偉業儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚腥草提取液的制備 將魚腥草用剪刀剪為長度為0.5至1.0cm,稱取40g魚腥草置于圓底燒瓶中,加入900mL蒸餾水,在微沸狀態下分3次回流提取,每次45min,過濾廢渣,濃縮濾液至500mL,得到魚腥草提取液。

1.2.2 殼聚糖絮凝除雜魚腥草提取液的工藝優化 殼聚糖絮凝劑的制備:用1%(體積分數)的乙酸溶液為溶劑配制1%(質量體積分數)的殼聚糖溶液,在室溫條件下先溶脹12h,然后低速攪拌,待完全溶解后便為殼聚糖絮凝劑。

1.2.2.1 單因素實驗 殼聚糖用量對絮凝除雜效果的影響：取5份15.0mL的提取液,將pH調節至6.5,分別向提取液中加入0.6、0.9、1.2、1.5和1.8mL 殼聚糖絮凝劑和1.2、0.9、0.6、0.3、0.0mL 1%的乙酸溶液,即殼聚糖用量分別為0.04、0.06、0.08、0.10和0.12g/100mL(殼聚糖用量表示為每100mL提取液中殼聚糖的加入量(g))。在40℃下水浴攪拌10min,靜置8h后過濾,將濾液濃縮至15.0mL,測定該澄清液的透光率和吸光度。

提取液pH對絮凝除雜效果的影響：取5份15.0mL的提取液,將pH分別調節為5.0、6.0、6.5、7.0和8.0,向提取液中加入0.6mL殼聚糖絮凝劑,在40℃下水浴攪拌10min,靜置8h后過濾,將濾液濃縮至15.0mL,測定該澄清液的透光率和吸光度。

提取液溫度對絮凝除雜效果的影響：取5份15.0mL的提取液,將pH調節至6.5,向提取液中加入0.6mL 殼聚糖絮凝劑,分別在30、40、50、60、70℃下攪拌10min,靜置8h后過濾,將濾液濃縮至15.0mL,測定該澄清液的透光率和吸光度。

1.2.2.2 正交實驗優化 以上述單因素實驗得出殼聚糖用量、提取液pH和溫度的3個水平,建立因素水平表(見下表1),以澄清液的透光率和黃酮保留率為指標,采用正交實驗確定絮凝除雜工藝的最佳殼聚糖用量、提取液pH和溫度。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 指標的測定及計算

1.2.3.1 黃酮含量的測定及其保留率的計算 測定方法主要參照參考國家藥典[20]中方法,但是略有改動。

溶液的配制:準確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品20mg,用60%(體積分數)的乙醇超聲溶解,并定容至50mL,得濃度為0.4mg/mL標準溶液。

標準曲線的繪制:準確吸取蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL,置于7個50mL的容量瓶中。分別向每個容量瓶中加入6mL蒸餾水和2mL 5%(質量體積分數)的NaNO2溶液,搖勻后放置6min,再加入2mL 10%(質量體積分數)的Al(NO3)3溶液,搖勻后放置6min,然后加入12mL 4%(質量體積分數)的NaOH溶液,最后加蒸餾水至刻度,搖勻后放置15min。在510nm的波長處測定各溶液的吸光度。建立回歸方程,繪制標準曲線。

黃酮含量的測定:取待測液1mL,按上述實驗方法,在510nm的波長處測定吸光度,求得黃酮含量。

黃酮保留率的計算:黃酮保留率(%)=(澄清后提取液中黃酮含量/澄清前提取液中黃酮含量)×100。

1.2.3.2 透光率的測定 取適量的待測液,以蒸餾水為空白對照,在最佳波長680nm處測定透光率。透光率是澄清液澄清度的指標,透光率越大,澄清度越高,絮凝除雜效果就越好。

1.3 殼聚糖絮凝法與醇沉法澄清效果的比較

1.3.1 醇沉法 取提取液15.0mL,加入45.0mL 75%的乙醇,靜置8h,待醇沉后過濾,將濾液濃縮至15.0mL,測定該澄清液的透光率和吸光度。

1.3.2 殼聚糖絮凝法 取提取液15.0mL,在正交實驗優化后得出的最佳條件下進行澄清,靜置8h后過濾,將濾液濃縮至15.0mL,測定該澄清液的透光率和吸光度。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁濃度(C)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標作圖,得到蘆丁標準曲線(圖1),其回歸方程:A=11.375C+0.001(相關系數R2=0.999),由圖可知,在0.01～0.06mg/mL范圍內蘆丁的濃度與吸光度具有良好的線性關系。

圖1 蘆丁濃度對吸光度的標準曲線Fig.1 Standard curve of concentration of rutin and the absorbance

2.2 殼聚糖用量對絮凝除雜效果的影響

殼聚糖用量對絮凝除雜效果的影響如圖2所示。由圖2可知,澄清液的透光率隨著殼聚糖用量的增大出現先增大后下降的趨勢,在用量為0.10mg/100mL時其透光率達到最大。這可能是因為殼聚糖用量較少時,隨著殼聚糖用量的增大,被絮凝的膠體顆粒增多,從而使澄清液透光率提高;而當殼聚糖過量時,提取液中的某些膠體顆粒表面會吸附過量的殼聚糖,形成空間保護層,使這些顆粒處于較穩定狀態,懸浮在液體中,導致澄清液透光率較低。黃酮保留率隨著殼聚糖用量的增大而減小,這是因為殼聚糖對黃酮有一定的吸附作用。從圖中可以得知,在殼聚糖用量為0.06mg/100mL時,澄清液的透光率和黃酮保留率都處于較高的水平。

圖2 殼聚糖用量對絮凝除雜效果的影響Fig.2 Effect of dosage of chitosan on flocculation impurity removal

2.3 提取液pH對絮凝除雜效果的影響

提取液pH對絮凝除雜效果的影響如圖3所示。由圖3可知,在pH為5～8區間內,隨著pH的增大,透光率和黃酮保留率都先增大后減小,且都在pH為6.5處達到最大值。透光率的變化可能受兩方面原因的影響,一方面,殼聚糖在pH為4.9時質子化程度最大,隨著pH增大,殼聚糖質子化程度逐漸降低,對膠體顆粒雙電層的壓縮能力減弱,導致絮凝除雜效果變差;另一方面蛋白質和鞣酸隨pH增大,表面負電荷逐漸增加,變得更容易與殼聚糖發生絮凝作用。黃酮保留率的變化可能與其在弱酸環境有較高的穩定性有關。

圖3 提取液pH對絮凝除雜效果的影響Fig.3 Effect of pH of extracting solution on flocculation impurity removal

2.4 提取液溫度對絮凝除雜效果的影響

提取液溫度對絮凝除雜效果的影響如圖4所示。從圖4中可知,在30～70℃范圍內,隨著溫度增高,透光率先升后降,在50℃時達最大值。這可能是因為溫度較低時,溫度的升高加快了膠體顆粒的布朗運動,增加了與殼聚糖的碰撞次數,提高了絮凝效果;但溫度過高,一方面使絮凝作用過快,導致絮狀沉淀細小,沉降慢甚至無法沉降[19];另一方面,高溫會使殼聚糖空間結構發生改變,導致絮凝活性下降。黃酮保留率先升后降再趨于平穩,在40℃時達最大值。綜合考慮澄清液的透光率和黃酮保留率,40℃是較佳的溫度。

圖4 提取液溫度對澄清效果的影響Fig.4 Effect of temperature of extracting solution on flocculation impurity removal

2.5 殼聚糖絮凝除雜工藝優化

正交實驗結果如表2所示,殼聚糖對魚腥草提取液絮凝除雜效果最佳的工藝應該使澄清液透光率較高,同時有效成分黃酮得到最大的保留,即黃酮的保留率越高越好。因此,在正交分析過程中需要綜合考慮這兩個指標,采用加權評分法對正交實驗結果進行分析。黃酮保留率是反映澄清液功能性成分的重要指標,因此評分時這一指標有更高的權重,把評分公式定為:得分=透光率×0.2+黃酮保留率×0.8;得分越高表示其絮凝除雜的效果越好。

表2 L9(34)正交實驗結果Table 2 L9(34)Design and results of orthogonal experiment

從表3中的極差分析可知,影響殼聚糖絮凝除雜魚腥草提取液的效果的因素主次順序是A>C>B,即殼聚糖的用量對澄清效果的影響最大,其次是提取液的溫度,最后為提取液pH,確定的最優方案為A1B1C1,即最佳工藝條件為:殼聚糖用量是0.04g/100mL、pH6.0,溫度30℃。正交實驗獲得的最佳因素與單因素實驗之間存在著一定的差距,這可能是由于它們之間的交互作用引起的。在此最佳工藝條件下,進行驗證性實驗,測得澄清液的黃酮保留率和透光率分別為80.0%和68.1%。殼聚糖絮凝除雜魚腥草提取液的工藝簡單且澄清效果好,對魚腥草中的有效成分也有較好的保留作用。

表3 極差分析Table 3 Range analysis

注：該表為加權得分的極差分析。

2.6 殼聚糖絮凝除雜法與醇沉法效果對比

殼聚糖絮凝除雜工藝與醇沉工藝的澄清效果對比如表4所示。由表4可知,殼聚糖澄清法能在獲得與醇沉法相似的黃酮保留率的同時,大幅提高透光率,顯著提高了魚腥草提取液的澄清效果。

表4 殼聚糖絮凝除雜法與醇沉法效果的對比Table 4 Comparison of the clarification effect by chitosan and alcohol

3 結論

殼聚糖用量、提取液pH和提取液溫度對殼聚糖絮凝除雜魚腥草提取液的效果都有不同程度的影響,殼聚糖用量的影響最大,其次是提取液溫度和提取液pH。許多研究學者都探究了相關因素對絮凝除雜效果的影響,一些研究學者[15,21-22]的結果也表明殼聚糖的用量對絮凝除雜效果影響最大。通過正交實驗優化得出了最佳澄清工藝條件,即殼聚糖用量為0.04g/100mL,提取液pH為6,溫度為30℃;在此條件下,黃酮保留率為80.0%,澄清液透光率達68.1%。與醇沉法相比,殼聚糖絮凝除雜法工藝簡單、成本低廉、效果好,在保留有效成分的同時顯著提高透光率,有良好的應用前景。

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Effect of chitosan on flocculation impurity removal of extracting solution from houttuynia

LI Si-dong1,CHEN Song1,HE Ming2,YANG Xi-hong1,*,LIU Li-li1,ZHUANG Qiao-ling3

(1. College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2. College of Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China;3. College of Science,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Effect of dosage of chitosan,pH and temperature of extracting solution on flocculation impurity removal of extracting solution from houttuynia were studied. Then the clarification process was optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimum process condition was that dosage of chitosan was 0.04g/100mL,pH of extracting solution was 6.0,temperature of extracting solution was 30℃. Under this condition,the flavones retention rate was 80.0%,the light transmittance was 68.1%,which indicated that using this method the active ingredients was well-preserved and the clarity was good. This method had good application prospect.

chitosan;extracting solution from houttuynia;flocculation;flavonoid

2014-04-18

李思東(1960-)，男，本科，教授，研究方向：海洋應用化學。

*通訊作者:楊錫洪(1963-)，男，博士，教授，研究方向：水產品質量與安全。

國家自然科學基金項目(31271938)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)01-0259-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.045