響應面法優化牛膝中齊墩果酸超聲波輔助提取工藝

趙明霞,歐陽杰,*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系,北京 100083;2.林業食品加工與安全北京市重點實驗室(北京林業大學),北京 100083)

響應面法優化牛膝中齊墩果酸超聲波輔助提取工藝

趙明霞1,2,歐陽杰1,2,*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系,北京 100083;2.林業食品加工與安全北京市重點實驗室(北京林業大學),北京 100083)

以牛膝為原料,以齊墩果酸提取得率為指標,采用超聲波輔助提取牛膝中齊墩果酸。分別研究了乙醇濃度、料液比、提取時間對齊墩果酸提取得率的影響,通過響應面實驗優化了提取工藝。結果表明,齊墩果酸提取的較佳工藝條件是:乙醇濃度70%,提取時間20min,料液比(w/v)1∶20。在此條件下,齊墩果酸的提取含量為11.14mg/g。

牛膝,齊墩果酸,超聲波輔助,提取工藝

牛膝(Achyranthesbidentata)為莧科牛膝屬的植物,分布于非洲、東南亞以及俄羅斯、朝鮮、中國等地,生長于海拔200～1750米的山坡林下[1]。牛膝的主要功效為補肝腎、清熱火,主治腰膝酸痛、下肢痿軟、咽喉腫痛等[2-3]。現代醫學證明,牛膝具有免疫調節、消炎抗菌、抑制腫瘤等作用[4-6]。在衛生部2009年公布的《藥食同源品名單》中,牛膝被列入保健食品的物品名單。

齊墩果酸(Oleanolic acid)為五環三萜類化合物,是牛膝中最主要的活性物質之一[7-8]。齊墩果酸的提取方法主要有甲醇和乙醇超聲提取并用大孔吸附樹脂純化,超臨界CO2流體萃取技術等[9-11]。牛膝齊墩果酸具有較高的開發利用價值,它既可以用于藥品,又可以用于功能食品和保健食品中[12-14]。本論文以牛膝為原料,采用單因素實驗和響應面分析法,優化了超聲提取齊墩果酸的方法,具有一定的研究和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

懷牛膝 購自同仁堂藥店;齊墩果酸標準品(純度≥98%) 購于中國食品藥品檢定研究院;無水乙醇、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯等化學試劑均為分析純 北京化學試劑公司。

T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；H/T16MM臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;TGCX2-2B超聲循環提取機 北京弘祥隆生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制作 精密稱取齊墩果酸標準品2mg,以無水乙醇為溶劑,定容于10mL容量瓶中,即得0.2mg/mL的齊墩果酸標準溶液。分別吸取齊墩果酸標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL(即分別含齊墩果酸0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg),置于具塞試管中,60℃加熱揮去溶劑后,加5%香草醛-冰醋酸0.2mL,高氯酸0.8mL。然后在70℃水浴中加熱15min,取出冷卻至室溫。再加乙酸乙酯定容至5mL,搖勻,在最大波長560nm處測定吸光度,同時以未加對照品的試劑空白作參比。以吸光度為縱坐標,齊墩果酸含量為橫坐標,得到的標準曲線方程為:A560nm=11.315C+0.0523,R2=0.9965。

1.2.2 牛膝齊墩果酸的提取 將牛膝清洗干凈,于70℃干燥4h,粉碎過40目篩,得牛膝粉末。稱取1g加入適量乙醇,在設定溫度下超聲波處理一定時間,處理后離心30min,浸提1h后抽濾,測定濾液中的齊墩果酸含量。

齊墩果酸提取含量(mg/g)=(CV)/M,其中,C:根據回歸方程計算齊墩果酸濃度(mg/mL);V:齊墩果酸提取液定容體積(mL);M:原料質量(g)。

1.2.3 齊墩果酸提取的單因素實驗方法 乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響:在超聲功率500W,在料液比為1∶15,超聲時間30min的條件下,分別選取乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%進行超聲提取。料液比對齊墩果酸提取含量的影響:在超聲功率500W,乙醇濃度為70%,超聲時間30min的條件下,分別選取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(w/v)進行超聲提取。提取時間對齊墩果酸提取含量的影響:在超聲功率500W,料液比1∶25,乙醇濃度70%下,分別選取超聲時間10、20、30、40、50min進行超聲提取。

1.2.4 齊墩果酸提取的響應面分析方法 在單因素實驗的基礎之上,應用響應面法中的Box-Behnken設計對提取乙醇濃度、料液比、超聲時間3個因素進行優化。實驗設計借助Design Expert 軟件,因素的水平及編碼如表1。

表1 中心組合設計實驗因素水平及編碼Table 1 Central Composite design experimental factor and coding

1.3 數據統計分析

所有實驗重復三次,取平均值,顯著性分析采用SPSS17.0軟件處理。

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響

乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響如圖1所示。隨著乙醇濃度的升高,齊墩果酸的提取含量先升高后下降,這可能與齊墩果酸的極性有關,當乙醇溶液體積分數為70%時,齊墩果酸的極性與之最為接近,所以提取含量最高,達到8.89mg/g,因此選70%乙醇濃度較為合適。

圖1 乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of oleanolic acid

2.2 料液比對齊墩果酸提取含量的影響

料液比對齊墩果酸提取含量的影響如圖2所示。隨著料液比增加,溶劑用量增加使得齊墩果酸的擴散濃度差增大,提高了擴散速度,提取含量迅速增加,當料液比為1∶25(w/v)時,提取含量達到10.62mg/g。當料液比為1∶30(w/v)時,齊墩果酸提取含量有所下降,可能是實驗誤差所致。理論上,隨著料液比越大,提取出的齊墩果酸應越多,但在整個提取過程中也會有部分損失而帶來誤差。

圖2 料液比對齊墩果酸提取含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of oleanolic acid

2.3 超聲時間對齊墩果酸提取含量的影響

當超聲功率為500W時,超聲時間對齊墩果酸提取含量的影響如圖3所示。超聲波時間太短對細胞破損造成的影響較小,仍有較多齊墩果酸在細胞內沒有被提取出來;超聲波時間太長,超聲波可能對齊墩果酸造成影響,使齊墩果酸提取含量減少。合適的超聲時間是20min,提取含量是10.32mg/g。

圖3 提取時間對齊墩果酸提取含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of oleanolic acid

2.4 齊墩果酸提取響應面優化實驗

2.4.1 實驗數據及模型的建立 依據上述單因素實驗結果,以乙醇濃度A、提取時間B和料液比C為變量,以齊墩果酸Y為響應值設計響應面實驗方案及結果見表2。

經Design Expert 7.0 軟件進行數據分析,經過響應面的回歸分析得到如下回歸方程為Y=11.48+0.27A+0.21B+0.98C+0.055AB+0.040AC+0.013BC-1.55A2-1.68B2-1.19C2

表3為回歸方程方差分析表,實驗所選用模型顯著(p<0.0001),擬合度好。方程的回歸系數顯著性檢驗表明,因素A和C對齊墩果酸含量的線性效應顯著,二次項影響顯著,其余因素影響不顯著,具體見表4。

表2 響應面分析實驗結果Table 2 Design and result of response surface methodology test

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Regression equation analysis of variance table

2.4.2 響應面圖分析結果 將一個因素同定在零水平,利用Design Expert 7.0軟件即可作出三種因素交互作用的響應曲面圖。響應面分析中,回歸方程中各變量對響應值的影響顯著性由F檢驗判定,理論上p值越小,則對應的響應值越顯著。當p<0.0001時,說明其所對應的條件對響應值的作用是極顯著的,p<0.05時則認為其影響顯著。逐項顯著性檢驗結果表明,一個一次項(C-C),三個二次項(A2,B2,C2)是對牛膝齊墩果酸提取含量影響顯著的項(p<0.0001)。綜合來看,二次項對響應值的影響顯著,說明各實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。圖4A、圖4B顯示了固定提取時間和料液比后,乙醇濃度對齊墩果酸提取含量的影響,由于齊墩果酸易溶于有機溶劑,隨著乙醇濃度的升高,齊墩果酸的提取含量先升高后下降,這可能與齊墩果酸的極性有關。當乙醇溶液體積分數為70%時,齊墩果酸的極性與之最為接近,所以提取含量最高。圖4A、圖4C顯示固定乙醇濃度和料液比后,提取時間對齊墩果酸提取含量的影響。隨著提取時間的增加,牛膝齊墩果酸提取含量先增加后減小。這說明充足的提取時間對于破壞細胞結構、擾動細胞表面、提高齊墩果酸釋放率是必須的。但是繼續增加時間會有其他雜質溶出,引起物質純度降低。圖4B、圖4C顯示固定乙醇濃度和時間后,料液比對齊墩果酸的提取含量的影響,在1∶25時提取含量最高,隨后提取含量減小,盡管料液比增加有利于齊墩果酸溶出,但在整個提取過程中總會有原料和成品的損失,料液比越大,損失越大,所以齊墩果酸提取含量在料液比1∶30(w/v)時有下降趨勢。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Table 4 Regression equation significance test

圖4 齊墩果酸提取得率影響的響應面交互作用圖Fig.4 Response surface plot for the effects on the extraction yield of oleanolic acid

2.4.3 最佳工藝及驗證實驗 根據所得到的模型,得到最佳工藝條件是乙醇濃度70.93%,提取時間20.66 min,料液比1∶20.08,在此條件下齊墩果酸的最大提取含量是11.70mg/g。為了檢驗預測結果是否與實際值相似,根據上述實驗結果進行了驗證實驗,考慮到實驗方便可行,將較佳工藝條件調整為乙醇濃度70%,提取時間20min,料液比1∶20(w/v)。在此條件下進行3次平行實驗,齊墩果酸的提取率為(11.14±0.14)mg/g,與響應面預測值11.70mg/g相比,相對誤差在5%以內。與模型的預測值基本一致,由此可以得出該模型可以很好的模擬齊墩果酸的提取條件。

3 結論

通過單因素實驗和Design Expert 7.0對牛膝中齊墩果酸的提取條件進行了優化,較優提取條件為乙醇濃度70%、提取時間20min、料液比1∶20。驗證實驗平均值為11.14mg/g,與預測值11.70mg/g相接近,說明響應面模型可以很好的模擬齊墩果酸的提取條件。本研究結果為工業化生產提供了相應的基礎數據,下一步研究將進行放大提取。

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《食品工業科技》雜志社

Optimization of ultrasonic assisted extraction of oleanolic acid from achyranthes by response surface methodology

ZHAO Ming-xia1,2,OUYANG Jie1,2,*

(1. Department of Food Science and Engineering,College of Biological Science and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2. Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Oleanolic acid was extracted from achyranthes root by ultrasonic assisted extraction. The effects of ethanol concentration,solid-liquid ratio,and extraction time on the extraction yield of oleanolic acid were investigated. The extraction technology was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions of oleanolic acid were as follows:ethanol concentration was 70%,extraction time was 20min,and solid-liquid ratio was 1∶20. Under above conditions,the extraction yield of oleanolic acid reached 11.14mg/g.

Achyranthes;oleanolic acid;ultrasound assisted;extraction

2014-04-15

趙明霞(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與安全。

*通訊作者:歐陽杰(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術。

第44批回國留學人員科研啟動基金。

TS201.2

B

1002-0306(2015)01-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.048