三重熒光定量PCR快速檢測水產品中的雙鏈DNA病毒的研究

黃佳鳴,寧喜斌,史秀杰,劉 葒,叢 健,蘭文升，*

(1.上海海洋大學食品科學與工程學院,上海 201306;2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,深圳市外來有害生物檢測技術研發重點實驗室,廣東深圳 518045)

三重熒光定量PCR快速檢測水產品中的雙鏈DNA病毒的研究

黃佳鳴1,2,寧喜斌1,史秀杰2,劉 葒2,叢 健1,蘭文升2，*

(1.上海海洋大學食品科學與工程學院,上海 201306;2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,深圳市外來有害生物檢測技術研發重點實驗室,廣東深圳 518045)

目的:建立對水產品中三種雙鏈DNA病毒(斑點叉尾鮰病毒、錦鯉皰疹病毒、流行性造血器官壞死病毒)快速、敏感、特異的檢測方法。方法:針對三種病毒的DNA聚合酶基因的保守序列設計三對特異性引物和三條Taqman探針,優化體系,建立三重熒光定量PCR體系,并對該方法的靈敏性和特異性評估。結果:建立的三重熒光定量PCR體系特異性強,引物之間及引物和探針之間無相互干擾。對三種病毒的檢測限均能達到102拷貝/μL。結論:該方法體系穩定,重復性好,可操作性強,對水產品中的雙鏈DNA病毒的快速檢測具有重要的應用價值。

斑點叉尾鮰病毒;錦鯉皰疹病毒;流行性造血器官壞死病毒;三重熒光定量PCR

我國是一個水生動物及其產品進出口大國和消費大國,各種水產食品已成為滿足我國人民日益增長的蛋白質需求的重要來源。然而,現實高密度養殖模式以及水環境的污染造成水生動物疫病頻發,在爆發的水生動物疫病中,病毒性疫病成為水生動物發病率較高和難以根治的最重要疫病,因此,病毒病成為水生動物健康養殖的關注焦點[1]。

水生動物DNA病毒病是由雙鏈DNA病毒引發,在水生動物中尚未發現單股單鏈DNA病毒,常見的引起魚類傳染病的雙鏈DNA病毒都屬于虹彩病毒科和皰疹病毒科[2]。主要有:流行性造血器官壞死病毒(EHNV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、斑點叉尾鮰病毒(CCV)、淋巴囊腫病毒(LCDV)。其中,EHNV、KHV、CCV三種病毒被農業部列入二類動物疫病,且EHNV、KHV同時被世界動物衛生組織列入《水生動物疾病診斷手冊》[3]。這些病毒引發的水生動物疫病給水產養殖業帶來的危害甚為嚴重。因此,在疫病尚未傳播時,及時檢出病原,采取積極防控措施,將減少由疫病帶來的經濟損失。

DNA聚合酶基因是診斷雙鏈DNA病毒感染的潛在靶標區域[4],目前已有許多專家學者以DNA聚合酶基因為目的基因,建立了對雙鏈DNA病毒的檢測方法[5-7]。通過對水生動物雙鏈DNA病毒的DNA聚合酶基因序列分析,發現雖然不同種病毒基因組序列差異較大,但是DNA聚合酶基因具有一定同源性,可以充分利用這些DNA聚合酶基因的同源區設計引物,然后利用基因片段之間仍然存在足夠的堿基差異,用高靈敏的探針加以鑒別[8]。

表1 制備陽性標準品的引物Table 1 Primers for positive standard

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用的CCV毒株購自ATCC(編號:ATCC-12665),用斑點叉尾鮰卵巢細胞系(CCO細胞系)增殖;KHV毒株為深圳出入境檢驗檢疫局動植中心水生動物檢測重點實驗室分離所得,用錦鯉尾鰭細胞系細胞系(KF-1細胞系)增殖;EHNV毒株為實驗室分離所得,用鯉上皮瘤細胞系(EPC細胞系)增殖;RSIV毒株為實驗室分離所得,由石鱸鰭條細胞系(GF細胞系)增殖;GFHNV毒株為實驗室分離所得,由KF-1細胞系增殖。病魚樣本:CCV病樣是由美國夏威夷大學魯元安老師于2005年贈送鮰魚組織,KHV病樣是由本實驗室于2010年從廣州某漁場的錦鯉中獲得的。

LB固/液體培養基干粉 購自life公司;病毒DNA抽提試劑盒 購自Qiagen公司;pMD18T載體、T4 DNA連接酶、PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒純化試劑盒 均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

ABI7500熒光定量PCR儀 美國ABI公司;核酸蛋白分析儀 德國Eppendorf公司;凝膠成像儀Gel Logic 4000 pro 美國柯達公司;電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 病毒DNA的提取 分別從感染CCV病毒的CCO細胞,感染KHV病毒的KF-1細胞,感染EHNV病毒的EPC細胞,感染RSIV病毒的GF細胞和感染GFHNV病毒的KF-1細胞中提取五種病毒的DNA,所用試劑盒為DNeasy? Blood&Tissue Kit(Qiagen),方法參考該試劑盒的使用手冊。

1.2.2 三種病毒陽性標準品的制備 用特異性引物組CF/CR、KF/KR和EF/ER(20μmol/L)通過PCR方法擴增DNA聚合酶基因片段,模板為從病毒的細胞培養物提取的DNA,DNA序列來自GenBank,見表1。PCR反應體系(50μL):Ex Taq酶緩沖液25μL(含DNA聚合酶和dNTP),上游引物1μL,下游引物1μL,模板6μL,ddH2O 17μL。反應條件:95℃預變性3min、94℃變性45s、退火溫度見表1、退火45s、72℃延伸80s為一個循環,進行31個循環后,72℃再延伸7min。電泳鑒定,并用試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa)分別回收相應目的片段,然后將回收的目的片段與pMD18-T載體連接。連接產物分別轉化E.coliDH5α感受態細胞,通過菌落PCR篩選陽性克隆,用試劑盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0(TaKaRa)提取質粒,測序鑒定。得到測序結果后,用核酸蛋白分析儀測定陽性質粒濃度,根據阿弗加德羅常數將濃度轉換為拷貝數,將獲得的重組質粒作為陽性對照參照標準。1.2.3 Taqman探針及其引物的設計與合成 根據GenBank中CCV、KHV和EHNV三種病毒的DNA聚合酶基因序列,運用Primer express 3.0軟件針對三種病毒分別設計引物并篩選出符合條件的探針序列,再運用BLAST分析探針的特異性,設計并得到表2中引物和探針,三種探針的5′端分別用FAM、JOE、TAMRA三種熒光染料標記,3′端用BHQ1猝滅集團標記。

1.2.4 引物、探針濃度及反應條件優化 將三種病毒陽性質粒稀釋,濃度大致為106拷貝/μL,以稀釋后的三種病毒陽性質粒為模板,按試劑盒Platinum? 定量PCR SuperMix-UDG的操作手冊進行熒光PCR反應。分別選用0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/L的引物濃度和0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/L的探針濃度,采用矩陣法篩選和確定引物和探針的最佳濃度,以獲得最低的CT值和較高的相對熒光強度增加值(ΔRn)時的引物和探針濃度為最佳。

1.2.5 三重熒光定量PCR的建立 三重熒光定量PCR反應體系(20μL):2×qPCR SuperMix-UDG 10μL,CCV引物(上下游各20μmol/L)0.5μL,KHV引物(上下游各20μmol/L)0.5μL,EHNV引物(上下游各20μmol/L)0.5μL,CCV探針(10μmol/L)0.5μL,KHV探針(10μmol/L)0.5μL,EHNV探針(10μmol/L)0.5μL,Rox 0.5μL,模板2μL,ddH2O 3μL。反應條件:95℃,10min;95℃,15s;60℃,1min;40個循環。

表2 三重熒光定量PCR使用的引物和探針Table 2 Primers and probes used in Triplex real-time PCR assay

1.2.6 特異性實驗 提取另外兩種雙鏈DNA病毒(RSIV和GFHNV)的DNA作為模板,分別進行三重熒光定量PCR檢測,以確定三重熒光定量PCR反應的特異性。

1.2.7 敏感性實驗 用分光光度計分別測定3種病毒的DNA陽性質粒的原始濃度,通過分子量計算出單位體積的拷貝數,并將3種病毒陽性樣品稀釋到相同濃度,分別混合均勻后,做10倍系列稀釋,得到3種病毒DNA濃度均為107、106、105、104、103和102拷貝/μL,利用已建立的三重熒光定量PCR的方法在同一試管檢測三種病原。

1.2.8 三重和單重熒光定量PCR方法的比較 為比較三重熒光定量PCR與單重之間的差異,將三種病毒混合后,十倍梯度稀釋,取混合液中濃度為106、105、104和103拷貝/μL的四個稀釋度為模板,然后分別用單重實時熒光PCR和多重實時熒光PCR進行檢測,每組做三個平行,以確定單重和多重實時熒光PCR之間的差異。

單重熒光定量PCR反應體系(20μL):2×qPCR SuperMix-UDG 10μL,引物(上下游各20μmol/L)0.5μL,探針(10μmol/L)0.5μL,ROX 0.5μL,模板2μL,ddH2O 6μL。反應條件:95℃,10min;95℃,15s;60℃,1min;40個循環。

1.2.9 三重熒光定量PCR對病魚組織樣的檢測 本研究用三重熒光定量PCR方法對相應的病魚樣本進行檢測,以驗證該方法的靈敏性和特異性,病料來源是深圳出入境檢驗檢疫局動植中心水生動物檢測重點實驗室保存的已經確診感染CCV病毒的和感染KHV病毒的病魚組織樣品,這兩種病料經實驗室PCR檢測并測序,確證分別感染了相應病毒。然而由于國內未有EHNV引起的發病報道以及沒有分離到相應的病原,本方法未能對該病毒的樣品進行檢測。DNA抽提使用試劑盒(DNeasy? Blood&Tissue Kit,Qiagen),方法參考該試劑盒的操作手冊。從病料中分別抽提兩種病毒的DNA,并將得到的DNA樣品按1∶1混合,用建立的三重熒光定量PCR方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 三重熒光定量PCR體系的建立

由圖1可知,同一反應體系中,三種信號間的影響不大,可以有效的區分出來。三種熒光信號的強度,FAM>JOE>TAMRA。對引物探針優化的實驗結果表明,不同濃度的引物和探針的配比對檢測結果的影響較大,而三種引物和探針的濃度比為2∶1時,效果較好。本實驗采用的是:三種引物的濃度為0.5μmol/L,探針為0.25μmol/L。

圖1 三重熒光定量PCR擴增曲線Fig.1 Amplification curve of the Triplex real-time PCR assay

2.2 三重熒光定量PCR特異性實驗

提取RSIV和GFHNV作為模板,分別進行三重熒光定量PCR檢測,以確定該方法的特異性,結果這兩種病毒都沒有擴增,說明該方法有較強特異性。

2.3 三重熒光定量PCR干擾性實驗

為確定3種病毒的探針、引物之間是否存在相互干擾現象,用三重反應體系分別對CCV、KHV和EHNV的DNA病毒模板進行擴增,結果均只有一種對應的特異性探針發生水解,得到一條與單重熒光PCR一致的典型曲線,另外兩種探針檢測顯示為陰性,說明各探針、引物之間無相互干擾現象。

2.4 三重熒光定量PCR敏感性實驗

對由3種混合的病毒稀釋的陽性標準品進行三重熒光定量PCR檢測,如圖2所示,A、B、C分別為CCV、KHV和EHNV的靈敏度測試結果。由圖可知在模板濃度為107拷貝/μL～102拷貝/μL時,濃度與CT值成正比;而當模板濃度為10拷貝/μL時,CT值與模板濃度不成線性關系,且呈現弱陽性。故三重熒光定量PCR對3種DNA病毒模板最低可檢測至102拷貝/μL。

圖2 三重熒光定量PCR靈敏度檢測Fig.2 Sensitivity detection of the Triplex real-time PCR assay注:A為CCV的靈敏度測試結果; B為KHV的靈敏度測試結果; C為EHNV的靈敏度測試結果。

2.5 三重和單重熒光定量PCR方法的比較

由表3可見,三重熒光定量PCR在對三種病毒的不同濃度模板檢測時,CT值每梯度之間相差在3.3左右,說明儀器操作帶來的誤差對CT值的影響較小,說明影響PCR的CT值差異的主要因素是模板濃度的變化。而變異系數介于0.24%～2.42%之間,說明該法具有良好的穩定性。對數據分析的結果,單重實時熒光PCR和三重熒光定量熒光PCR在同一濃度模板檢測上并沒有明顯差異。

2.6 三重熒光定量PCR對病魚組織樣品的檢測

圖3為實際組織樣品的檢測結果,含CCV的五個重復樣品檢測結果CT值為13.8,根據陽性樣品的標準曲線,檢測濃度為107拷貝/μL,說明樣本中含有CCV核酸濃度較高,含KHV的五個重復樣品檢測結果CT值為19,根據陽性樣品的標準曲線,檢測濃度為105拷貝/μL,說明樣本中含有KHV核酸濃度略少,該方法能夠有效的區分CCV和KHV,引物和探針之間沒有相互干擾現象,檢測一致性較好。而且,檢測結果不受樣品中其它核酸的影響,表明該檢測方法中的引物和探針具有很好的特異性。

表3 四種不同稀釋度模板的單重 和三重熒光定量PCR效果比較Table 3 Amplification comparison of singlet and Triplex real-time PCR assay on four different dilutions template

*注:三重熒光定量的CT值與各自單重熒光定量的CT值無顯著差異(p>0.05)。

圖3 三重熒光定量PCR對受感染病魚的檢測Fig.3 Detection of infected diseased fish by the Triplex real-time PCR assay

3 結論與討論

OIE手冊推薦的水生動物病毒檢測方法全部基于普通PCR技術,但是在具體操作過程中發現這種傳統經典方法敏感性仍然不夠高,經常發生漏檢現象(通過細胞分離法做比對實驗驗證)[9]。由于熒光定量PCR具有自動化程度高、無需電泳、靈敏度高和檢測速度快等的特點,因此,對病原的實際檢測中該方法具有很高的實用性。國內外已有通過熒光定量PCR技術對水產品種出現的雙鏈DNA病毒檢測研究[10-14],目前,主流熒光定量PCR方法對各種病原的檢測仍然是一對一的檢測方法,在大批量樣品的篩選時,單重熒光PCR在成本和工作效率上存在較大的劣勢,因此高通量、低成本、高效率的進行批量快速檢測將是未來檢測技術的發展趨勢[15-16]。

本實驗針對斑點叉尾鮰病毒(CCV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV)三種病毒的DNA聚合酶基因設計引物探針,應用PCR儀器的多通道檢測功能,建立了基于三條不同熒光信號標記的Taqman探針的三重熒光PCR檢測體系。實驗驗證了三重方法的特異性,對同屬的病原具有很好的鑒別能力,同時,也排除了3種探針和相應引物之間的干擾性。比較實驗的結果也表明單重實時熒光PCR和三重熒光定量PCR在相同模板檢測上并沒有明顯差異,對三種病毒的檢測下限均能達到102拷貝/μL,相比普通PCR方法具有很高的靈敏性。因此,本實驗建立的三重熒光定量PCR就可以對樣品中存在的一種或多種雙鏈DNA病毒做出檢測,從而大大提高了工作效率,節省了檢測成本。本文也為針對水產品中其他的雙鏈DNA病毒多重熒光定量PCR檢測技術提供了參考依據。

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Study on rapid detection of double-stranded DNA viruses by the Triplex real-time PCR assay

HUANG Jia-ming1,2,NING Xi-bin1,SHI Xiu-jie2,LIU Hong2,CONG Jian1,LAN Wen-sheng2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306，China;2.Shenzhen R&D Key Laboratory of Alien Pest Detection Technology,Animal & Plant Inspection and Quarantine Technical Center,Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Burea,Shenzhen 518045,China)

Object:Establish rapid,sensitive and specific methods of detecting three double-strand DNA viruses,Channel catfish virus(CCV),Koi herpesvirus(KHV),Epizootic hematopoietic necrosis virus(EHNV),from fish samples. Method:Three pairs of specific primers and three Taqman probes were designed targeting for conserved sequence of DNA polymerase gene of three kinds of virus. The Triplex real-time PCR assay was established. The sensitivity and specificity of the method were evaluated. Results:The sensitivity of this method was 102copy·μL-1for detecting DNA of three viruses. The assay was specified for three kinds of virus CCV,KHV and EHNV. In the experiment,non-interference between primers and probes was found. Conclusion:The Triplex real-time PCR assay was a stable and reliable method for rapid detection of three double-strand DNA viruses in aquatic animal products.

CCV;KHV;EHNV;Triplex real-time PCR

2014-04-08

黃佳鳴(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品安全。

*通訊作者:蘭文升(1968-),男,博士,高級獸醫師，研究方向:水生動物疫病學。

國家質檢總局科技計劃項目(2013IK052)；深圳出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(SZ2011003)。

TS254.7

A

1002-0306(2015)01-0311-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.057