新疆傳統酸奶中乳酸菌的篩選鑒定及菌相分析

楊 潔,張文亮,鄒建軍,胡 敏,袁雪林,劉云國

(新疆大學 生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046)

新疆傳統酸奶中乳酸菌的篩選鑒定及菌相分析

楊 潔,張文亮,鄒建軍,胡 敏,袁雪林,劉云國*

(新疆大學 生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046)

酸奶是新疆各少數民族經常食用的一種乳制品。從新疆采集的22個酸奶樣品中共分離出56株乳酸菌,通過形態特征觀察、生理生化實驗、糖發酵實驗等傳統鑒定方法,結合16S rDNA序列分析對其進行鑒定。結果表明,新疆傳統酸奶中菌相構成為德氏乳桿菌(Lactobacillus.delbrueckiisubsp.)46株(占總分離株的82%);發酵乳桿菌(Lactobacillus.fermentum)2株(4%);瑞士乳桿菌(Lactobacillus.helveticus)2株(4%);嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)1株(2%);雞乳桿菌(Lactobacillus.gallinarum)2株(4%);屎腸球菌(Enterococcusfaecalis)1株(2%);耐久腸球菌(Enterococcuscanis)2株(4%)。說明新疆傳統酸奶中德氏乳桿菌為優勢菌。

新疆傳統酸奶,乳酸菌,菌相,16S rDNA序列分析

乳酸菌指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1]。這類細菌在自然界分布廣泛,在工業、農業和醫藥等與人類生活密切相關的領域中應用價值很高。目前至少可分為18個屬,共有200多種。除極少數外,其中絕大部分都是人體內必不可少的且具有重要生理功能的菌群,廣泛存在于人體的腸道中。新疆地域遼闊,自然環境和氣候差異都很大,新疆農牧民制作酸奶的經驗豐富、歷史悠久,乳酸菌資源具有無可比擬的生物多樣性和基因多樣性[2-4]。因而,篩選鑒定新疆傳統酸奶中的乳酸菌并分析其菌相構成具有重要的意義。

生理生化實驗及糖發酵實驗是一種常見的細菌鑒定方法,每一種細菌的生命活動和新陳代謝都是獨一無二的,他們的新陳代謝活動和其代謝產物也不盡相同[5-7]。近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,16S rDNA序列測定技術也應用到了細菌的鑒定及菌相構成分析中[8-11]。細菌的16S rDNA基因大小適中,既含有高度保守序列,也具有相當的變異區,是一種簡單、快速的在種、屬水平上鑒定大量菌株遺傳關系的方法,通過構建細菌系統發育樹,能夠較好地反映出屬、種分類地位和系統進化親緣關系,為細菌種屬鑒定和近緣種研究提供可靠依據[12]。

本研究從新疆喀什地區采集的22個酸奶樣品中共分離得到56株乳酸菌,通過形態特征觀察、生理生化實驗、糖發酵實驗等傳統鑒定方法,結合16S rDNA序列分析對其進行了鑒定和分類,分析了新疆傳統酸奶中的菌相構成。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 采集自喀什及周邊地區農牧民家中,其中采自喀什市的樣品7份、阿圖什市4份、塔什庫爾干縣11份,共計22份樣品。利用樣品無菌采集管采集酸奶樣品,每一樣品分3份于冰盒保存,12小時內送于實驗室-70℃保存,備用。

過氧化氫,盧戈氏碘液,結晶紫,番紅,95%乙醇,吲哚試劑,溴甲酚紫;MRS液體培養基、MRS固體培養基、MC固體培養基、M17固體培養基以及糖發酵基本培養基;無抗生素脫脂奶粉 新疆喀什南達乳業。

超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;HZQ-X100培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;高速冷凍離心機 力康有限公司;SpectrumLab53紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司;C100S型PCR儀 美國Bio-Rad公司;pHS-25型pH計 上海精科雷磁有限公司。

1.2 樣品的活化

在篩選乳酸菌之前需要將樣品活化。按酸乳發酵條件活化樣品,即以3%的接種量將樣品加入12.5%(w/v)的脫脂乳中,42℃發酵4～6h,待酸乳凝固后按上述條件進行二次發酵后待用。

1.3 乳酸菌的篩選及純化

首先將活化的樣品稀釋涂布,取10mL樣品加入到90mL無菌生理鹽水中,形成10-1的稀釋液,隨后從中取出1mL加入9mL生理鹽水管中形成10-2的稀釋液,之后依次稀釋成10-3、10-4、10-5的稀釋液。分別取0.1mL的稀釋液涂布于加有2%(w/v)碳酸鈣的MRS培養基、改良MC培養基和M17培養基上,置于37℃恒溫培養48h,挑取有融鈣圈的單菌落進行劃線純化。

1.4 生理生化及糖發酵實驗

篩選及純化的菌株進行吲哚實驗、葡萄糖產酸產氣實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、石蕊牛奶實驗等生理生化實驗及糖發酵實驗,參照《常見細菌系統鑒定手冊》[1]、《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[13]和《伯杰系統細菌學手冊》[14]進行鑒定。

1.5 乳酸菌的發酵以及感官實驗

對分離得到的單菌落接入到12.5%的脫脂乳中,發酵4～6h后移入4℃放置6～8h后熟,對其凝乳狀態和感官指標進行評價。

1.6 乳酸菌DNA的提取

DNA提取按照試劑盒說明書(Beijing Solarbio)的要求操作,略有改動,第二步添加了溶菌酶,用以乳酸菌破壁。

1.7 乳酸菌16S rDNA PCR擴增

乳酸菌16S rDNA PCR擴增體系見表1。引物采用細菌通用擴增引物,正向引物27f:(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),反向引物1492r:(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。

擴增循環為94℃ 5min,預變性;94℃(1min)、58℃(1min)、72℃(2min),35個循環;72℃延伸10min。擴增完畢后,取3μL PCR擴增產物與2μL loading buffer混合點樣,用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,若PCR成功則在1500bp左右可見清晰條帶。擴增產物送寄于上海生工生物工程有限公司測序。

表1 16S rDNA PCR擴增體系Table 1 PCR amplification system of 16S rDNA

1.8 16S rDNA序列系統發育分析

代表性菌株的16S rDNA序列通過BLAST獲取與所測序列相似度最高的序列,ClustalX進行多重序列比對,利用聚類分析軟件Mega 5,采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離及菌落特征

在加有2%(w/v)碳酸鈣的MRS培養基、改良MC培養基和M17培養基上挑取有明顯融鈣圈的菌落,進行純化,共得到56株乳酸菌,實驗菌經染色后,在油鏡下觀察呈現藍紫色,均為革蘭氏染色陽性菌。實驗菌的菌體形態可分為兩類:球狀和短桿狀;球狀菌均為單個或成鏈狀,短桿菌成單個或成對出現。根據菌落和菌體形態對比,可以發現球狀乳酸菌的菌落要比短桿狀乳酸菌的菌落小,表2列出了分離到的凝乳狀態和感官評價結果較好的11株菌的形態特征。

2.2 生理生化及糖發酵實驗

將分離到的56株乳酸菌進行生理生化及糖發酵實驗,表3是其中11株菌的生理生化鑒定結果,表4是糖發酵實驗結果。

表2 乳酸菌的形態特征Table 2 Characteristics of Lactic acid bacteria

注:“+”表示革蘭氏陽性

表3 生理生化鑒定結果Table 3 Result of identification physico-chemical properties

注:“+”表示陽性“-”表示陰性。

表4 糖發酵實驗結果Table 4 Results of sugar fermentation

注:“+”表示陽性“-”表示陰性。

由表3可見,產氣的菌株為Alt-1-a、Alt-1-b、Alt-2(2)、KS-4-b和KS-5-b(2),屬于異型發酵,其余為同型發酵。根據生理生化反應和形態學特征,初步判定所篩選出的球菌HT-b、HT-e、HT-f為鏈球菌屬,桿菌為乳桿菌屬。

圖1 16S rDNA PCR擴增結果Fig.1 16S rDNA PCR amplification results

2.3 16S rDNA PCR擴增產物的電泳檢測

用1%的瓊脂糖凝膠對分離菌的16S rDNA擴增產物進行電泳檢測,通過凝膠成像系統照相并觀察,圖1是其中11株菌的16S rDNA PCR擴增結果。從圖1可知,除了Alt-2(2)和Alt-1-a兩珠菌外,均有擴增產物。

2.4 16S rDNA序列系統發育樹及菌相分析

通過BLAST比對,選取GenBank中16株與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的參比菌株做系統發育樹分析(表5)。

圖2 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA seaqences

對菌株的16S rDNA序列與GenBank數據庫中參比菌株的相應序列進行比較鑒定,用MEGA 5軟件以NJ法繪制系統發育樹(圖2)。BLAST序列比對表明基因序列全部歸屬于乳酸菌。系統發育分析歸為乳酸桿菌科和腸球菌科。所有分離的56株乳酸菌的16S rDNA序列通過BLAST比對鑒定,其菌相構

表5 用于多序列比較的參比菌株Table 5 List of the strains used

成為德氏式乳桿菌Lactobacillusdelbrueckiisubsp.46株,占所篩選菌種數的82%;發酵乳桿菌Lactobacillusfermentum2株,占所篩菌種數的4%;瑞士乳桿菌Lactobacillushelveticus2株,占所篩菌種數的4%;嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilusstrain1株,占所篩菌種數的2%;雞乳桿菌Lactobacillusgallinarumstrain 2株,占所篩菌種數的4%;屎腸球菌Enterococcusfaecium1株,占所篩菌種數的2%;耐久腸球菌Enterococcusduransstrain 2株,占所篩菌種數的4%。說明新疆傳統酸奶中菌相構成以德氏乳桿菌為優勢菌。

3 結論

新疆喀什、和田等地是中國的長壽之鄉,酸奶是當地居民食用量最多的一種乳制品。乳酸菌是世界公認的益生菌,新疆傳統酸奶中存在著大量的乳酸菌菌群,其實際應用價值非常高,因而,篩選鑒定新疆傳統酸奶中的乳酸菌并分析其菌相構成具有重要的實際意義。本研究從新疆采集的22個酸奶樣品中共分離出56株乳酸菌,通過形態特征觀察、生理生化、糖發酵實驗等傳統鑒定手段,結合16S rDNA序列分析對其進行鑒定。結果表明新疆傳統酸奶中德氏乳桿菌占絕對優勢(82%),其他菌株所占比例較小,如發酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雞乳桿菌、屎腸球菌、耐久腸球菌等各占2%～4%。

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Screening,identification and microflora analysis of Lactic acid bacteria from Xinjiang traditional yogurts

YANG Jie,ZHANG Wen-liang,ZOU Jian-jun,HU Min,YUAN Xue-lin,LIU Yun-guo*

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

Yogurt is one of the poplular dairy foods for minority nationalities in Xinjiang. Fifty-six Lactic acid bacteria were isolated from 22 yogurt samples collected from Xinjiang. They were identified by observation of morphological characteristics,physiological and biochemical tests,sugar fermentation tests,and sequence analysis of 16S rDNA. The microflora in Xinjiang traditional yogurts include 46 strains ofL.delbrueckiisubsp,accounted for 82%,2 strains ofL.fermentum,accounted for 4%,1 strains ofEnterococcusfaecalis,accounted for 2%,and 2 strains ofEnterococcuscanis,accounted for 4%. It indicateed thatL.delbrueckiisubspwas the dominant bacteria in Xinjiang traditional yogurts.

Xinjiang traditional yogurt;Lactic acid bacteria;microflora;16S rDNA

2014-02-20

楊潔(1963-)，女，博士，副教授，研究方向：生物化學和天然產物研究。

*通訊作者:劉云國(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術。

TS252

A

1002-0306(2015)01-0324-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.060