鱟試劑檢測復方柳安咖注射液中細菌內毒素的可行性研究

趙 祎 張紅宇 王 莉 李海山

云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011

藥物研究

鱟試劑檢測復方柳安咖注射液中細菌內毒素的可行性研究

趙 祎 張紅宇 王 莉 李海山

云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011

目的：通過對復方柳安咖注射液進行細菌內毒素檢查法研究，建立復方柳安咖注射液細菌內毒素檢查方法。方法：采用2010年版 《中國藥典》（二部）附錄XIE細菌內毒素檢查法進行。結果：復方柳安咖注射液經80倍及以上稀釋，對細菌內毒素檢查法（凝膠法）無干擾作用。結論：細菌內毒素檢查法適用于復方柳安咖注射液中內毒素的檢測。

復方柳安咖注射液；細菌內毒素檢查；干擾試驗

復方柳安咖注射液又名撒痛風注射液，是水楊酸鈉、安替比林、咖啡因的復方制劑，臨床主要用于治療風濕、類風濕關節炎，急、慢性關節炎，痛風，疼痛，發熱。該品種收載于 《國家藥品標準》第十一冊［1］。目前，該復方制劑的質量控制研究主要采用HPLC法對復方柳安咖注射液中的三種主要成分進行含量測定與分析［2－4］，而對細菌內毒素的檢查未見有關方面的報道［5－6］。本實驗參照2010年版 《中國藥典》 （二部）附錄XI E細菌內毒素檢查法［7］，采用兩個廠家的鱟試劑對來自3個生產企業12個批次的復方柳安咖注射液進行細菌內毒素的檢查，考察并建立該品種細菌內毒素的檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Binder FD115烘箱（德國BINDER公司）；GL－88B旋渦混合器（江蘇海門麒麟醫用儀器廠）；TW20恒溫水浴（德國JULABO公司）。

1.2 試藥試劑 鱟試劑（TAL，批號：1406032，λ＝0.5EU／m l，規格：0.1ml／Amp，湛江安度斯生物有限公司；批號：1404170，λ＝0.5EU／ml，規格：0.1 ml／Amp，湛江博康海洋生物有限公司；批號：1405250，λ＝0.25EU／ml，規格：0.1 ml／Amp，湛江博康海洋生物有限公司）；細菌內毒素工作標準品（WSE，批號：201175，規格：120 ml／Amp，中國食品藥品檢定研究院）；細菌內毒素檢查用水（WBET，批號：1309230，湛江安度斯生物有限公司；批號：1311080，湛江博康海洋生物有限公司）；復方柳安咖注射液（批號：130707、130902、130903、130904，西南藥業股份有限公司；批號：14041127、14031217、14031317、14031417，四川美大康華康藥業有限公司；批號：121206、121207、131002、131003，桂林南藥股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復核 將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15 min，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30 s。每個濃度均平行做4管，另外2管加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照管。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，放入（37±1）℃的恒溫水浴中，保溫（60±2）min后觀察。將試管緩緩倒轉180°，若管內形成凝膠，且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成不結實、變形并從管壁滑脫者為陰性。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值 （λc）。λc＝antilg（∑Χ／4），當λc在0.5～2.0λ范圍內時，鱟試劑靈敏度符合規定，可用于細菌內毒素檢查。結果表明2個批號的鱟試劑的λc值均在0.5～2.0λ范圍內，結果見表1。

2.2 細菌內毒素限值L的確立 根據說明書中復方柳安咖注射液用法用量：皮下注射或肌內注射，一次2m l（1支），一日1～2次。按2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅪE細菌內毒素檢查法計算內毒素限值：根據公式L＝K／M（其中K為人每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K＝5EU／（kg·h），M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，按體重60 kg計算，M＝2m l／（60·kg·h）；限值L＝150 EU／m l，最終確立復方柳安咖注射液細菌內毒素限值 L為：應小于150 EU／m l。

2.3 最大有效稀釋倍數（MVD）的計算 按公式MVD＝ CL／λ計算，L＝150 EU／ml，C為供試品溶液濃度，當L以EU／m l表示時，則C等于1.0 ml／ml，λ為鱟試劑標示靈敏度，目前市售TAL最高靈敏度為0.03 EU／m l，可計算得復方柳安咖注射液MVD＝150 EU／m l／0.03125 EU／ml＝4800倍。由此可知，樣品可在稀釋倍數小于4800倍的情況下進行內毒素檢查。

表1 鱟試劑靈敏度復核Tab.1 Test for confirmation of labeled TAL sensitivity

表2 干擾預試驗測定結果Tab.2 Results of test for preliminary interfering factors

表3 干擾試驗結果Tab.3 Results of test for interfering factors

2.4 復方柳安咖注射液干擾預試驗 每個生產廠家挑選一批進行干擾預試驗，用細菌內毒素檢查用水WBET對復方柳安咖注射液進行稀釋，使稀釋倍數分別為10、20、40、80、160、320、640倍，將此系列溶液記為樣品供試液，取相應濃度樣品稀釋液加入標準內毒素溶液制成內毒素濃度為2λ和0.25λ的樣品供試液，取TAL（批號：1404170）與上述系列溶液進行反應，每一濃度重復2管。結果見表2。

由表2預干擾試驗結果可初步了解，復方柳安咖注射液經40倍及以上稀釋對TAL與內毒素的反應無干擾。為進一步確證有無干擾因素，用復方柳安咖注射液80倍稀釋液進行如下干擾試驗。

2.5 復方柳安咖注射液干擾試驗 為進一步確認復方柳安咖注射液在作80倍稀釋后對鱟試劑無干擾作用，按2010年版 《中國藥典》（二部）附錄ⅪE細菌內毒素檢查法 “供試品干擾試驗”項下規定進行。將來自3個廠家共9批的復方柳安咖注射液分別用細菌內毒素檢查用水（WBET）作80倍稀釋。用WBET及80倍稀釋的復方柳安咖注射液分別將細菌內毒素標準品（WSE）配成濃度為1.0、0.5、0.25、0.125 EU／ml的試驗液，用兩批λ為0.5 EU／ml的不同廠家的TAL進行試驗，每個濃度平行4管，結果見表3、4。

實驗結果按Es＝antilg（∑XS／4）和Et＝antilg（∑Xt／4）計算，其中XS和Xt分別為WBET稀釋系列和80倍稀釋的復方柳安咖注射液稀釋系列的反應終點濃度的對數值。當在0.5λ～2.0λ范圍內時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。由表3、4結果可知，復方柳安咖注射液在80倍稀釋時，對細菌內毒素檢查法無干擾作用。

表4 干擾試驗結果Tab.4 Results of test for interfering factors

表5 復方柳安咖注射液細菌內毒素檢查結果Tab.5 Results of test for bacterial endotoxin in the Compound Sodium Salicylate Antipyrine and Caffeine Injection

2.6 復方柳安咖注射液凝膠限度試驗 按擬訂的細菌內毒素限值L＝150 EU／m l，用靈敏度為0.25 EU／ml的鱟試劑對不同廠家的復方柳安咖注射液進行細菌內毒素檢查。取12個批次的復方柳安咖注射液樣品，分別用WBET稀釋至600倍濃度的溶液為供試品管，用作300倍稀釋的樣品溶液與濃度為1.00 EU／ml的內毒素溶液等體積混合，制成供試品陽性管，以0.5 EU／ml的內毒素溶液為陽性管，WBET為陰性管，（37±1）℃的恒溫，（60±2）min后觀察結果（均設2個平行管），詳見表5。

由表5可知，復方柳安咖注射液細菌內毒素含量均低于150 EU／m l，符合擬定的限值要求。

3 討論

細菌內毒素檢查法是近年來發展較快的用于檢測藥品及其中間品內毒素污染的一種方法。在美國、歐洲及日本等發達國家，大部分的注射劑均采用細菌內毒素檢查法。我國于1990年將該法收載入 《中國藥典》，自此，采用該方法檢測細菌內毒素的品種逐年增多。

研究結果發現，用鱟試劑對三批復方柳安咖注射液進行干擾試驗，Et結果均在0.5～2.0 Es范圍內，表明復方柳安咖注射液經80倍以上稀釋對細菌內毒素檢查法 （凝膠法）無干擾，對12批不同廠家的復方柳安咖注射液依法檢驗，結果均符合2010年版 《中國藥典》規定，合格率為100%，其細菌內毒素項可擬訂為：取本品依2010年版《中國藥典》（二部）附錄XIE項下檢查，每1m l中含細菌內毒素的量應小于150 EU。

復方柳安咖注射液現行質量標準為 《化學藥品地方標準上升國家標準》WS－10001－（HD－1087）－2002，其安全性檢查項目僅有無菌項。根據 《化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則》［8］，生產工藝易污染細菌內毒素的肌內注射用注射劑，應考慮設細菌內毒素檢查項。復方柳安咖注射液臨床使用為皮下注射或肌內注射，而現行標準中并未收載細菌內毒素檢查項，為提高復方柳安咖注射液臨床用藥的安全性，加強對注射液的質量控制，建議增訂該項目。

［1］WS－10001－（HD－1087）－2002.復方柳安咖注射液［S］.

［2］莫文電，石文松，楊帆.HPLC法同時測定復方柳安咖注射液中3組分的含量［J］.中國藥師，2008，11（9）：1081－1083.

［3］岑淑姬，辛俊衡.HPLC法同時測定復方柳安咖注射液中水楊酸鈉和安替比林的含量［J］.廣西醫科大學學報，2008，25（5）：762－763.

［4］陳華文，辛俊衡.HPLC測定復方柳安咖注射液中咖啡因的含量［J］.首都醫藥，2008（9）：51－52.

［5］辛俊衡，汪鋅華.高效液相色譜法同時測定復方柳安咖注射液中3組分含量［J］.中國藥業，2008，17（18）：39－40.

［6］丁培芳，崔郭勤.高效液相色譜法測定井岡水楊酸鈉水劑中水楊酸鈉含量［J］.廣東化工，2011，38（8）：139－140.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （二部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄99－102.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （二部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄212.

Feasibility study on bacterial endotoxin of compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection w ith the TAL

ZHAO Yi ZHANG Hongyu WANG Li LIHaishan
Yunnan Institute for Food and Drug Control，Kunming 650011，China

Objective To establish amethod for the bacterial endotoxin testof compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection.M ethod The bacterial endotoxin testwas carried out according to the appendix XIE of Chinese Pharmacopoeia（Vol.Ⅱ，edition 2010）.Result The compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection by diluting to a concentration ofmore than eighty times was noninterference for bacterial endotoxin test of gel－clot.Conclusion The bacterial endotoxins test is suitable for the detection of endotoxin in the compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection.

compound sodium salicylate antipyrine and caffeine injection；bacterial endotoxins；interference test

R927.1

A

1007－8517（2015）17－0009－04

2015.06.04）

趙祎（1982－），女，云南瀘西人，主管藥師，主要從事藥檢、藥理工作。E－mail：755024741＠qq.com