正交試驗優選通竅活血膠囊水提工藝

雷曉翠安紅偉*頓玲露趙世亮徐 榛王少洲

1.廣西壯族自治區柳州市中醫院，廣西 柳州 545001；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001

正交試驗優選通竅活血膠囊水提工藝

雷曉翠1安紅偉1*頓玲露1趙世亮2徐 榛2王少洲2

1.廣西壯族自治區柳州市中醫院，廣西 柳州 545001；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001

目的：優選通竅活血膠囊的最佳提取工藝。方法：以芍藥苷含量和干膏率為評價指標，利用正交試驗考察加水量、提取時間、提取次數對通竅活血膠囊提取工藝的影響，采用HPLC法測定芍藥苷的含量。結果：最佳提取工藝為加12倍量水提取3次，每次30min；芍藥苷含量為21.10mg／g，干膏率為23.42%。結論：優選的提取工藝穩定可行，為通竅活血膠囊的合理開發提供參考。

通竅活血膠囊；正交試驗；芍藥苷

通竅活血膠囊是由赤芍、川芎、桃仁、紅花、紅棗、鮮姜、老蔥、麝香等多味中藥組成的制劑，具有活血化瘀，通竅活絡的作用。藥理研究發現，通竅活血膠囊可以改善腦組織的病理學損傷、保護腦組織抗氧化酶的活性、減輕氧自由基對腦組織的損傷［1］，并減輕微循環障礙［2］。為了合理制定通竅活血頰囊的提取工藝，研究根據處方中藥物有效成分的理化性質和藥理作用，結合中醫臨床用藥的特點，采用正交試驗法對通竅活血膠囊的提取工藝進行研究，現報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV－1800紫外可見分光光度計（上海美析儀器有限公司）；MS204－S電子天平（梅特勒－托利多）；VP－1400H型真空泵（東莞市普立真空設備有限公司）；DHG－9140A型電熱鼓風干燥箱（上海越眾儀器設備有限公司）；YZ－180DB型超聲波清洗儀 （上海越眾儀器設備有限公司）；S.HH.W21.600S型數顯式三用電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥 芍藥苷對照品（批號：110736－201438，中國藥品生物制品檢定所）；赤芍芍等飲片購于國藥控股廣西中藥飲片有限公司。乙腈（批號：141175，美國Fisher）、甲醇（批號：140400，美國Fisher）為色譜純；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計 本方臨床以湯劑形式應用，且方中藥材主要有效成分多為皂苷和多糖類成分，均有較好的水溶性，所以本實驗采用水煎煮法提取。以處方中赤芍所含的有效成分芍藥苷的含量及干膏得率為評價指標，并按以上兩指標的權重系數分別為80%和20%進行綜合加權評分［3］。采用L9（34）正交試驗對加水量 （A）、提取時間（B）、提取次數 （C）進行優選。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.2 干膏得率測定 精密吸取正交試驗濃縮液10m l，置于已恒重的干燥蒸發皿中水浴蒸干后，置于105℃烘箱中干燥至恒重，迅速置于干燥器放冷，稱重，計算得膏率。

2.3 芍藥苷含量測定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－0.1%磷酸（14：86）［4］；流速：1ml／min；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；進樣量：l0μl。理論塔板數按芍藥苷峰計算應不低于3000，分離度應不低于1.5［5］。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取在芍藥苷對照品3.10mg，置10 ml容量瓶中，加適量甲醇溶解，再加甲醇至刻度制成濃度為0.31mg／ml的對照品溶液，搖勻，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備 按處方量精密稱取處方中各味中藥 （麝香、黃酒除外），按照正交試驗設計的因素參數進行試驗，提取，過濾，合并濾液，濃縮至1∶1，精密吸取濃縮液1m l置蒸發皿中，水浴蒸干，加適量甲醇溶解過濾至25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。

2.3.4 陰性對照液的制備 制備缺白芍藥材的提取液，按“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3.5 線性關系考察 分別取“2.3.2”項下對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 ml置于10 m l溶量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取上述各對照品溶液10μl，按上述色譜條件注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量 （μg）為橫坐標 （X），繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝36472X－91686（R2＝0.9948，n＝6）。表明芍藥苷在6.20～37.1μg范圍呈良好線性關系。

2.3.6 陰性樣品干擾考察 精密吸取陰性對照溶液10μl注入液相色譜儀，發現在與芍藥苷對照品出峰的相應位置上，陰性供試品無相應色譜峰出現，說明樣品中的其他成分不干擾芍藥苷的測定。圖譜見圖1。

2.3.7 含量測定 分別精密吸取“2.3.2”項下的對照品溶液與“2.3.3”項下的供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，測定芍藥苷的含量。對照品、供試品及陰性對照圖譜見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 正交試驗結果 按L9（34）正交試驗表進行試驗，結果見表2、表3。

表2 水提工藝正交試驗結果

表3 方差分析結果

由表2、表3可知：影響提取效果的因素大小順序為：C＞A＞B，即提取次數＞加水量＞提取時間，加水量 （A）和提取次數（C）有顯著影響，且C3＞C2＞C1，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1。由于提取時間對結果沒有顯著性影響，故選擇提取時間為30min，最佳工藝為A3B1C3，即加12倍量水提取3次每次30min。

2.5 驗證試驗為進一步驗證優選工藝的可靠性，分別取3份按處方比例混合的藥材，按照優選的最佳條件進行試驗，結果表明，優選的提取工藝切實可行。見表4。

表4 水提工藝驗證試驗結果

3 討論

3.1 指標參數的確定 通竅活血膠囊含有多味中藥，成分較為復雜，故選擇干膏率作為考察指標之一。芍藥苷為方中赤芍的主要活性物質之一，是一種潛在的神經保護藥。研究發現芍藥苷能通過減少腦組織自由基的產生、抑制脂質過氧化反應、抑制內源性神經肽內皮素的產生，從而對沙土鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用［6］；通過提高機體消除自由基能力和增加Nrf2表達來減輕局灶性腦缺血再灌注損傷后自由基引起的氧化損傷作用，從而對缺血性腦組織起到腦保護作用［7］，故選擇芍藥苷作為另一考察指標。

3.2 評分方法 試驗設定了芍藥苷含量和干膏率兩個考察指標，故采用綜合加權評分法，可以兼顧各項指標，以各試驗綜合得分評價試驗結果，可化多指標為單指標進行分析，簡單方便。

3.3 指標權重系數的確定 多指標成分綜合評價優選中藥提取工藝，應該結合各指標成分對試驗結果的影響來確定指標成分在綜合加權評分法中的權重系數。根據試驗的目的，處方中指標性成分芍藥苷的含量對提工藝的影響更重要，故評分時設定干膏率和芍藥苷含量的權重分別占綜合評分的20%和80%，以優選出更具科學性和合理性的提取工藝［8］。3.4 HPLC流動相的確定 實驗在選擇流動相時，參照《中國藥典》赤芍項下的芍藥苷含量測定方法，經過數次的試驗，其中包括改變流動相組成：分別嘗試以甲醇 －0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液，甲醇－0.05%磷酸，甲醇－0.1%磷酸，乙腈－0.1%磷酸溶液為流動相進行洗脫；改變流動相比例：對乙腈－0.1%磷酸溶液的比例18：82、 17：83、16：84、15：85、14：86、13：87進行比較，結果以乙腈－0.1%磷酸溶液（14：86）為最佳洗脫條件，此時的峰形較好，分離度大于0.5，理論塔板數大于3000。所以實驗選取乙腈－0.1%磷酸溶液（14：86）為流動相。3.5 提取工藝的確定 通過對干膏率和芍藥苷含量綜合加權評分的分析，確定其最佳提取工藝為以12倍量水提取3次，每次30min。并以此工藝進行3批驗證試驗，兩項指標重復性好（RSD%＜2%），表明優選的提取工藝穩定可行、提取簡便、易于操作，符合生產的要求。

［1］汪寧，劉青云，彭代銀，等.通竅活血湯對腦缺血大鼠的保護作用及機制研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2004，11（5）：407－409.

［2］葛金文，陳大舜，朱惠斌，等.王清任三逐瘀湯對心肌缺血家兔凝血及纖溶功能的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2000，7（1）：22－24.

［3］李霞，梁惠珍，門九章.正交試驗優選雄芍顆粒的水提取工藝 ［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（5）：40－41.

［4］楊慈海，范常龍.高效液相色譜法測定斑禿丸中芍藥苷的含量 ［J］.海峽藥學，2014，26（3）：45－46.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：147.

［6］李冬梅，徐麗，張淑珍，等.芍藥苷對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用［J］.醫學研究生學報，2014，27（11）：1139－1142.

［7］何錦悅，饒夢琳，唐蜜，等.芍藥苷對局灶性大鼠腦缺血再灌注腦組織中SOD、Nrf2表達的影響及神經保護作用［J］.2014，38（2）：178－182.［8］蔡軍.正交實驗優選退黃口服液提取工藝［J］.中國醫學創新，2013，10（26）：128－130.

Optim ization of Extraction Technology for Tongqiaohuoxue Capsule by Orthogonal Test

Lei Xiaocui1An Hongwei1*Dun Linglu1Zhao Shiliang2Xu Zhen2Wang Shaozhou2
1.Liuzhou traditional Chinese Medical Hospital，Guangxi Liuzhou 545001，China；2.Guangxi University of Chinese Medicine，Guangxi Nanning 530001，China

Objective To optimize the extraction technology for Tongqiaohuoxue Capsule.M ethod The extraction conditions were optimized by orthogonal test，with the solvent volume，extraction time and extraction times as the influencing factors，the contentof the Paeoniflorin and the yield of dry extractwere used as the evaluation indexes.The content of paeoniflorin was detected by HPLCmethod.Result The optimal extraction conditionswere：refluxing extraction for 3 times and 30min each time with 12 fold amount of water. The content of the paeoniflorin was 21.10 mg／g and the yield of dry extractwas 23.42%.Conclusion The extraction technology is reasonable，reliable，and provides a foundation for the further production and quality control of Tongqiaohuoxue Capsule.

Tongqiaohuoxue Capsule；Orthogonal test；paeoniflorin

R284.2

A

1007－8517（2015）20－0006－03

2015.07.06）

廣西中醫藥管理局中醫藥科技專項課題 （制劑類課題，GZYZ1124）；柳州市科技創新能力與條件建設項目 （NO. 2013F010401）。

雷曉翠，女，碩士，藥師，研究方向：藥劑學。E－mail：wuxiaocuilei＠163.com

安紅偉，男，副主任醫師。E－mail：ahw0305＠163.com