高劑量肺癆康對耐多藥結核分枝桿菌的抑制作用*

陳歡 葉品良 張豐華 張傳濤 楊思捷 王帥

“肺癆康”是由百部、白芨、天冬等11味中藥組成，經臨床長期實踐總結出的一首經驗方。前期研究發現肺癆康可以促進肺結核患者臨床癥狀和肺部體征消失，促進肺部病變吸收，痰涂轉陰[1]。在體外抗菌試驗研究發現，肺癆康對耐利福平結核桿菌具有抑制作用[2]。在體內抗菌實驗研究發現，高劑量肺癆康（灌胃給藥劑量6 g/kg）對耐利福平結核菌具有抑制作用[3]。本實驗旨在前期研究基礎之上，觀察高劑量肺癆康對耐利福平結核分枝桿菌感染小鼠的臟器指數影響及主要臟器病理形態學變化，探討高劑量肺癆康對耐利福平結核分枝桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 肺癆康：由天冬、沙參、麥冬、阿膠、百部等組成，所需藥品均購自同仁堂藥店成都分店，采用常規方法煎煮后濃縮，制備成每毫升含生藥1 g的藥液，冷藏備用，使用前用生理鹽水稀釋。對照藥：利福平，由沈陽紅旗制藥有限公司生產，國藥準字：H21021905，規格：0.15 g/膠囊。

1.2 實驗菌株 H37RV標準菌（ATCC：27294），由中國疾病預防控制中心臨床分中心提供；單耐利福平（A菌組INH編號：332，B菌組INH編號073），由四川省疾病預防控制中心提供。

1.3 實驗動物 健康昆明種小白鼠100只，雌性，SPF級，體重（20±2）g，由四川省醫學科學院動物實驗研究所提供，合格證號為：SCXK（川）2012-24。

1.4 實驗儀器 培養箱A2型：力康生物醫療科技控股有限公司；生物安全柜BHC-1300ⅡA2：上海精宏實驗設備有限公司；電熱鼓風干燥箱CS101-2EBN：重慶四達實驗儀器有限公司恒達儀器廠；電子恒溫水箱：北京中興偉業儀器有限公司；顯微鏡Bx-43：Olympus；手動輪轉式切片機Leitz1516：Leica；全自動染色機Autostainer XL：Leica；全自動脫水機TSJ-Ⅲ：常州市中威電子儀器有限公司；病理組織漂烘儀PHY-Ⅲ：常州市中威電子儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 動物造模 100只雌性小鼠按隨機原則抽取20只小鼠作為空白對照組后，余下的小鼠全部以尾靜脈注射0.4 mL濃度為5×104CFU/mL的耐藥結核菌液造模，穿刺部位壓迫止血1 min。

1.5.2 動物分組 造模2周后，進行PPD試驗，將試驗陽性小鼠隨機分為模型組、利福平組、肺癆康組、肺癆康與利福平聯合組（后簡稱：聯合組），共四組，每組20只，分籠飼養，造模小鼠與空白組小鼠隔離飼養。

1.5.3 動物給藥 空白對照組、標準菌株組和耐藥菌株組均給予同體積生理鹽水每日灌胃一次，連續灌胃56 d。利福平組：給予同體積的利福平每日灌胃一次，連續灌胃56 d。肺癆康組：給予同體積的高劑量肺癆康混懸液（6 g/kg）每日灌胃一次，連續灌胃56 d。聯合組：給予同體積的利福平及肺癆康混懸液（6 g/kg）每日灌胃一次，連續灌胃56 d。

1.5.4 指標測定 各組小鼠治療前稱取質量一次，治療后每周稱取質量一次，觀察并記錄各組動物的存活時間，分別于治療8周后處死小鼠，取小鼠全肺和脾臟觀察小鼠每個臟器的結核結節，臟器的病理形態學變化（HE染色），并研磨、稀釋后接種于改良羅氏雞卵平皿培養基上，37 ℃培養4周后觀察結核菌數。

HE染色法具體方法為：取下新鮮的動物組織塊（一般厚度不超過0.5 cm）投入預先配好的固定液中（10%中性福爾馬林溶液），使組織、細胞的蛋白質變性凝固，以防止細胞死后的自溶或細菌的分解，從而保持細胞本來的形態結構。將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋，冷卻凝固成塊即成。將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為5~8 μm厚度。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干。染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。

1.6 統計學處理 結果采用SPSS 17.0統計軟件處理，計量資料結果均以（x-±s）表示，組間計量資料比較采用組間t檢驗，計數資料用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體重變化及存活時間 與空白組比較，模型組動物死亡時體重明顯降低（P<0.05），通過高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯合組治療后動物死亡時體重與模型組動物死亡時體重比較，各組動物死亡時體重明顯升高，其中高劑量肺癆康組、聯合組與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組動物平均存活天數明顯縮短（P<0.05），經過高劑量癆康組（6 g/kg）、聯合組治療后動物存活天數有所延長，其中高劑量肺癆康組、聯合組與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 小鼠體重變化及存活時間比較（x-±s）

2.2 小鼠臟器系數及肺臟結核結點變化 與空白組比較，模型組肺臟系數和肝臟系數明顯增加（P<0.05），脾臟系數降低（P<0.05），通過高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯合組治療后可以降低肺臟系數和肝臟系數，升高脾臟系數。其中高劑量癆康組、聯合組與模型組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。模型組小鼠肺部均產生肺部結節，通過高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯合組治療后可以明顯減少肺結節的生成，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 小鼠臟器病理組織學結果 通過藥物造模后各組動物肝、脾和肺部均發現炎性改變，采用高劑量肺癆康，利福平和聯合組治療后可以不同程度緩解肝、脾和肺部炎性病變。見表3。

表2 小鼠臟器系數及肺臟結核結點變化（x-±s）

3 討論

耐藥性肺結核是指耐一種或一種以上抗結核藥物的肺結核，屬于慢性緩發性傳染性疾病，由于藥物的濫用及結核桿菌菌種的變異，導致耐多藥結核病病例不斷增加[4]。據報道目前至少有27.8%的肺結核患者對現有肺結核藥物耐藥[5]。目前西藥對于利福平單耐藥結核病以利福平、吡嗪酰胺和鏈霉素為核心加用乙胺丁醇，根據病史及病變嚴重程度、確定是否加用氟喹諾酮類藥物，至少注射3個月，總療程不少于9個月[6]。根據相關研究報道利福平單耐藥結核病采用標準的治療方案及多種聯合給藥均可取得較為滿意的臨床效果[7-9]。

表3 小鼠臟器病理組織學結果 只

中醫學認為耐藥性肺結核屬于“肺癆”范疇，臨床以咳嗽、咯血、潮熱、盜汗及身體逐漸消瘦為主要特征[10]。目前中醫藥已成為抗肺結核的常用藥，其中百部、海浮石、大蒜、黃連、夏枯草、狼毒，貓爪草、苦參能增強感染肺結核小鼠的免疫力[11-12]，水車前、貓爪草、苦參具有抑菌作用[13]。中藥復方保真湯、百部丸、海浮石丸、抗癆保肺丸、保肺丸、地榆稚草湯、月華丸及百合固金湯，與抗結核西藥聯合使用可以改善臨床癥狀，減輕抗結核藥物的毒副作用，降低耐藥率，可以有效應用于耐藥性肺結核的治療[14-23]。

本次實驗結果顯示高劑量肺癆康、高劑量肺癆康與利福平聯合治療后均能升高耐多藥結核模型小鼠的體重，降低升高的肺臟系數和肝臟系數，減少肺部結節數，延長模型小鼠的存活時間。病理結果顯示，高劑量癆康，高劑量肺癆康與利福平聯合治療后均可以不同程度緩解肝、脾和肺部炎性改變。對此筆者認為高劑量癆康，高劑量肺癆康與利福平聯合后可以通過緩解肝、脾和肺部臟器的炎性反應，從而降低肺臟系數和肝臟系數，進而說明高劑量肺癆康對耐多藥結核模型小鼠具有較好的治療作用，但是起具有治療作用的機制還有待進一步深入研究。

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