去卵巢致大鼠腰椎間盤退變模型初探*

馮帥華 吳官保 楊屆 尹青 李勇敏 武海兵 劉澤庚

椎間盤退變引起的腰椎間盤突出、腰椎失穩、滑脫等均是臨床上的常見病。國內外關于椎間盤退變的病因和發病機制尚無定論，構建能模擬人椎間盤退變的動物模型是研究的關鍵，既往多采用直接或間接對椎間盤進行損壞制作腰椎間盤退變模型，本研究改變既往造模方法，采用去卵巢方法，試圖建立女性絕經后腰椎間盤退變的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8個月齡健康雌性SD大鼠（購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）30只，體重350~400 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗分組及動物模型的建立 30只大鼠按照隨機數字表法分為三組：空白組（A組）、假手術組（B組）、模型組（C組），每組各10只。采用摘卵巢手術制造去勢大鼠模型方法：C組用氯胺酮（50 mg/kg）行腹腔注射麻醉，在無菌條件下從距離大鼠第一胸腰椎外側1 cm處縱向切開皮膚及兩側肌肉，摘除雙側卵巢[1]，B組則切除等同于卵巢體積大小的脂肪，止血后分兩層縫合，術后連續3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠10萬U單位/d，A組不做任何處理。

1.2.2 模型成功的判斷依據 陰道細胞涂片：術后24 h開始行陰道細胞涂片，連續5 d。用小滴管吸生理鹽水少許，滴于大鼠陰道口內，吸出少量陰道分泌物，涂于載玻片上，立即置于95%的乙醇中固定30 min后取出晾干，做蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。去卵巢后大鼠表現為動情間期，無或者有少量角化上皮細胞，表示去勢成功。

1.2.3 觀察指標與檢測 第13周后處死所有大鼠，取出大鼠腰椎部分，剔除椎體周圍軟組織，經L5/6、L6/S1椎間隙取出椎間盤組織。L5/6椎間盤組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，常規HE染色，顯微鏡下對其椎間盤組織進行觀察，利用Wang等制定的椎間盤組織學評分系統對大鼠椎間盤髓核、纖維環及骨贅的形態學退變程度進行評分，根據退變程度的加劇其得分增加（髓核0~3分，纖維環0~2分，骨贅0~2分），一個椎間盤的得分為這3項得分的總和。同時每個標本隨機1個400倍高倍標準視野，進行脊索細胞計數。將所取L6/S1椎間盤組織立即放入2.5%戊二醛溶液中固定24 h；2%的鋨酸固定2 h，0.1M二甲砷酸鈉沖洗3次，間隔2 h進行一次后過夜；0.1M二甲砷酸鈉沖洗2次，間隔2 h進行一次；乙醇梯度脫水，環氧樹脂-環氧丙烷混合液浸泡24 h，Epon 812包埋；切片、染色，LKB-Ⅲ超薄切片機進行超薄切片，厚度約500埃，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察、攝片：各標本在不同視野和放大倍數下進行觀察椎間盤髓細胞數目和體積、胞漿內容物（細胞核、線粒體、內質網等）形態改變情況，并攝片，用MICROTEK3600 掃描儀掃描負片，圖像輸入計算機。

1.3 統計學處理 所有數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行處理，計量資料以（x-±s）表示，組間比較若方差齊時選擇LSD法，方差不齊時選擇Dunnett T3法進行方差分析和兩兩比較，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下椎間盤組織形態學表現及退變程度評分 空白組和假手術組腰椎間盤纖維環與髓核排列基本規則，軟骨細胞單層排列與纖維膠原層交替分層，髓核中脊索細胞相對其他組豐富（見圖1、2）；模型組腰椎間盤纖維環膠原纖維層和軟骨細胞多分布不規則，膠原纖維減少或有裂隙，軟骨細胞增多，逐漸取代纖維成分或基本為軟骨成分，髓核成分減少或消失，可見骨化，皺縮，脊索細胞明顯減少或消失（見圖3）；喂養第13周后的退變程度評分比較：空白組（1.90±0.99）分，假手術組（2.10±1.10）分，模型組（5.00±1.10）分。假手術組與空白組比較差異無統計學意義（P=0.691）；模型組與空白組比較差異有統計學意義（P=0.000）。

圖1 空白組（HE染色×40）

圖2 假手術組（HE染色×40）

圖3 模型組（HE染色×40）

2.2 400倍光鏡下脊索細胞計數 治療第13周時隨機1個400倍高倍標準視野下脊索細胞數量：空白組（16.80±4.04）個，假手術組（16.20±4.13）個，模型組（10.30±4.06）個。模型組脊索細胞計數較空白組及假手術組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）；空白組與假手術組比較差異無統計學意義（P=0.720），表明去卵巢后加速了大鼠椎間盤內脊索細胞的消失，加速了椎間盤的退變。見圖4、5。

圖4 脊索細胞數量較少（HE染色×400）

2.3 髓核細胞超微結構觀察 空白組和假手術組類軟骨細胞少，細胞稍有退變，細胞核呈卵圓形或圓形，核膜完整、光滑，異染色質比較豐富，細胞質內粗面內質網比較豐富并且有小的線粒體，散在分布糖原顆粒及少量的脂肪滴，細胞外常見細突起，其外有基質包圍，未有明顯的巢樣結構（見圖6、7）；模型組類軟骨細胞更少見，退變程度明顯加重，和空白組比較差異較為顯著，周圍有大量細胞周間質，形成鮮明的巢樣結構。細胞內溶酶體明顯增多，胞核扭曲變形，常染色質凝集成塊，分布于核膜下或散在分布，胞漿基質密度加深、線粒體空泡化加重，整個細胞體積明顯縮小，凋亡細胞核固縮成團或碎裂成多塊，散在于胞質中，胞質模糊不清，在致密的無定形基質中見一些粗顆粒狀物或空泡，胞膜缺如（見圖8）。

圖5 脊索細胞較多（HE染色×400）

圖6 空白組（×4.0K）

圖7 假手術組（×4.0K）

圖8 模型組（×4.0K）

3 討論

椎間盤由軟骨、外層的纖維環和內部凝膠樣的髓核構成，椎間盤細胞由髓核細胞及纖維環細胞組成，脊索細胞存在于椎間盤髓核組織內，起源于內胚層。相關研究表明脊索細胞隨著人類年齡增長其數量會逐漸較少甚至消失，并逐步被軟骨細胞代替[2-3]。Wang等[4-5]發現髓核內脊索細胞凋亡是椎間盤退變的起始點，是退變的主要病理基礎。從Guehring等[6]認為，隨年齡的增長，脊索細胞的消失甚至被取代可能原因是椎間盤失去血運所致。吳靖平等[7]發現增齡和應力都能加速大鼠脊索細胞減少，從而加速椎間盤退變，其變化規律與人類一致。椎間盤纖維環破裂、髓核突出的組織病理學基礎是髓核細胞數量的減少以及其生理活性下降[8]。

椎間盤退變會導致一系列的脊柱類疾病，而其原因現未完全明確，從現有研究來看是多種因素作用的結果[9]。椎間盤退變始于髓核內部細胞的凋亡和基質的重建。外層纖維環隨退變的發展改變了它正常的板層排列結構，降低了椎間盤承重的機械強度，隨退變程度增加，內層纖維環出現放射狀裂隙，并向外層延伸，致椎間盤完整性的喪失，并逐隨之出現有椎間盤退變引起的腰椎間盤突出癥、腰椎椎體不穩、腰椎側彎、腰椎旋轉畸形等疾病。椎間盤退變機制主要包括：家族遺傳，椎間盤營養供應減少，細胞凋亡失衡，基質酶活性改變，生物力學機制的改變，細胞因子的作用及自身免疫反應等[10-11]。

目前常用于研究椎間盤退行性疾病的模型可分為體內、體外模型，體內椎間盤退變模型可分為誘發性和自發性兩種，體外椎間盤退變模型可分為細胞培養模型和椎間盤組織培養模型[12]。誘發性椎間盤退變模型主要包括脊柱應力改變、破壞脊柱結構致脊柱失穩、直接破壞椎間盤組織等方法，其中手術損傷椎間盤突出模型也是目前在研究椎間盤退行性變疾病中常用的方法[13]。但目前尚無公認的能夠完全模擬人類椎間盤退變的標準模型[14]，因此臨床實驗研究中，應充分考慮各模型的適用性及局限性，以便選擇合適的動物模型，為了能更好地為人類椎間盤退變研究提供支持，椎間盤退變動物模型的研究仍任重道遠。

劉清華[15]研究發現，卵巢切除去勢方法建立骨質疏松大動物模型可引起椎間盤退變。臨床工作中發現絕經后婦女出現腰椎退行性疾病的不在少數，絕經這一因素是否加速了人類椎間盤退變目前尚無明確定論。本實驗采用爬行類動物大鼠作為研究對象，此類動物在一定程度上減少了生物力學對椎間盤退變的影響，普通大鼠的平均壽命在2.0~3.5年，性成熟年齡在2~8個月之間，實驗中選擇8個月齡性成熟大鼠，再行造模手術，使去卵巢這一因素是否參與了椎間盤退變更具有可信度。

統計學結果顯示，大鼠去卵巢后第13周腰椎間盤組織形態退變嚴重、脊索細胞數量減少，其退變評分和脊索細胞計數和空白組及假手術組比較差異有統計學意義（P<0.05），同時模型組髓核細胞超微結構退變較空白組及假手術組更為明顯。

綜上所述，去卵巢這一因素加速了大鼠椎間盤的退變，性成熟雌性大鼠通過去卵巢這一方法能初步建立腰椎間盤退變模型，這種模型模仿現實中絕經婦女椎間盤退變模型，為臨床進一步研究如何防止絕經后婦女腰椎間盤退變提供初步動物模型。

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