北五味子黃酮提取及其生物活性研究

宮 莉， 李彤輝， 包 雪，劉 野， 劉智輝

（長春工業大學 化學與生命科學學院，吉林 長春 130012）

0 引 言

天然黃酮類化合物屬于植物細胞的次級代謝產物，廣泛存在于中草藥植物中，是自然界藥用植物中主要活性成分之一，具有抗菌、消炎、降血脂及清除自由基和抗氧化能力，對防止疾病、抗衰老、增加機體免疫力、促進人體健康有著積極的意義［1－6］。

北五味子（Schisandra Chinensis）是木蘭科植物五味子的成熟果實，是我國重要的名貴中藥材之一，主要分布于遼寧、吉林、黑龍江等地。其性溫潤，治療作用廣泛，有斂肺生津、補腎寧心、收斂固澀之功效。五味子的果實中除含有多糖、木脂素、揮發油等成分外，還含有檞皮素、山萘酚等黃酮類化合物［7－10］。目前，有關五味子黃酮提取的研究報導相對較少［9－12］，尤其是有關五味子黃酮提取方法及五味子黃酮的抗氧化活性、抑菌活性等方面的研究尚未見報導。本實驗對五味子黃酮的提取方法、提取工藝條件及其生物活性進行了較全面、細致的研究，以期為五味子的產業開發提供參考。

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 實驗材料

北五味子成熟果實，采于吉林省長白山區。

1.2 主要試劑

蘆丁標準品、石油醚、95%乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、鄰苯三酚、Tris－HCl緩沖 液、PBS緩沖溶液、鄰二氮菲、FeSO4、H2O2等。

1.3 主要儀器

WD800微波爐，LG電子電器有限公司；

KQ－25OB超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；RE52－98旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；AL104電子分析天平，上海梅特勒－托利多儀器廠；

UV762雙光束紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；

LGJ－10冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠。

2 實驗方法

2.1 材料預處理

北五味子果實，60℃恒溫干燥至恒重，粉碎，細粉經石油醚60℃索氏回流脫脂3次，每次1h。干燥至恒重，置于真空干燥器中保存備用。

2.2 提取方法的選擇

準確稱取預處理后的五味子干粉5.0g，以料液比1∶30（g／mL）加入60%的乙醇，浸泡30min，分別采用超聲波法［10－11］、微波法［13－14］及常規的熱回流法［15－16］提取五味子黃酮。每種方法平行做3次，考核3種方法對提取率的影響。

2.3 超聲波法提取條件的優化

稱取預處理的五味子干粉5.0g，于250mL三角瓶中，加入乙醇溶液，常溫下攪拌浸泡30min后，采用超聲波法提取五味子黃酮，各條件平行做3次?？己肆弦罕?、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波處理時間、處理溫度等條件對提取率的影響。在此基礎上對提取條件進行正交優化，所得黃酮提取液經減壓蒸餾濃縮后，冷凍干燥保存。

2.4 黃酮含量測定

采用硝酸鋁顯色法測定提取液中五味子總黃酮的含量。

2.4.1 標準曲線繪制

參考石太淵［10］的方法并有所改進。分別吸取蘆丁－70%乙醇標準溶液（0.1mg／mL）0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL置 于10mL容量瓶中，對應加入5.00、4.80、4.60、4.40、4.20、4.00、3.80mL的70%乙醇，搖勻，分別加入10%亞硝酸鈉溶液0.30mL，搖勻，放置6min。加入4%氫氧化鈉溶液4.00mL，搖勻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，以0.00mL蘆?。掖既芤簽閷φ眨?10nm處測吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程y＝10.18x＋0.001 4，R2＝0.999 88，在0.000～0.012mg／mL濃度范圍內，蘆丁濃度與吸光度具有良好的線性關系。

2.4.2 總黃酮得率的測定

準確吸取五味子總黃酮提取液1.00mL，用70%乙醇稀釋并定容至50mL。取1.00mL待測液于10mL容量瓶中，按2.4.1中的方法，于510nm處測定其吸光度，代入回歸方程，計算出黃酮含量c（mg／mL），并按下式計算黃酮得率（mg·g－1）：

2.5 五味子黃酮抗氧化性能研究

2.5.1 對超氧陰離子自由基（O－2·）清除能力的實驗

參考史禮貌［17］、李鵬婧［18］的研究，采用鄰苯三酚自氧化法，于325nm處，每隔30s測定反應體系的吸光度，分別計算出鄰苯三酚的自氧化速率ΔA0和加入不同質量濃度五味子黃酮樣品后的鄰苯三酚自氧化速率ΔAx，以同濃度的Vc做對照。·清除率計算如下式：

2.5.2 對羥基自由基（·OH）清除能力的實驗

參考陳宗保［14］、史禮貌［17］的研究，采用Fenton反應，在6支10mL棕色容量瓶中分別加入1mmol／L的鄰二氮菲溶液1.0mL、pH值為7.4的PBS緩沖溶液2.0mL、1mmol／L FeSO4溶液1.0mL、0.1%（v／v）的H2O21.0mL，搖勻。向其中5支容量瓶中分別加入不同質量濃度的五味子黃酮樣品各2.0mL，最后用蒸餾水定容至10mL，搖勻，37℃保溫1h，于510nm處測定未加受試物的吸光度A0和各樣品吸光度Ax，以同濃度的Vc做對照，按下式計算·OH清除率。

2.6 五味子黃酮抑菌性能實驗

參考劉冬梅［19］的研究，采用牛津杯抑菌法，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為實驗菌，考核不同濃度的五味子黃酮水溶液的抑菌效果。

3 結果與分析

3.1 五味子黃酮提取方法的選擇結果

3種方法提取五味子黃酮的實驗結果見表1。

表1 3種方法提取五味子黃酮的實驗結果

由表1可知，在3種提取方法中，微波法得率最低，超聲波法和熱回流法得率相對較高，尤其是超聲波法得率最高為37.01mg／g，且用時較短，溫度易于控制。這是由于超聲波產生的機械作用及熱效應等能加速物料中有效成分的擴散和浸出，較熱回流法大大縮短了提取時間，提高了有效成分的提取率和原料的利用率。在提取實驗中還發現，微波法雖用時短，但溫度升高較快且難以控制，溶劑蒸發量較大，不僅黃酮得率較低，其生物活性也較其他兩種方法所得黃酮活性弱。

3.2 五味子黃酮提取正交實驗

根據單因素試驗結果，將超聲波功率設定為300W，選擇提取溫度、提取時間、乙醇濃度及料液比這4個對實驗影響較大的因素，設計L9（34）的正交試驗，實驗安排、實驗結果、實驗結果的方差分析分別見表2、表3和表4。

表2 超聲波提取五味子黃酮的正交試驗因素與水平表

表3 超聲波提取五味子黃酮的正交試驗結果表

從表3中的極差可以看出，影響總黃酮得率的各因素主次順序為B＞C＞D＞A，優化的提取條件為B2C1D3A1。

表4 正交實驗結果方差分析

從表4中的方差分析結果可以看出，乙醇濃度對提取率有極顯著影響，提取溫度有顯著影響。根據F值可以看出，各因素對提取率影響的大小次序為B＞C＞D＞A，這與直觀分析法得出的結果一致。

按照提取條件為B2C1D3A1的工藝條件進行了3次驗證性試驗，結果五味子總黃酮平均得率為41.25mg／g，是石太淵［10］等方法的1.87倍，且具有較強的生物活性。

3.3 五味子黃酮抗氧化性能

圖1 五味子黃酮對·的清除作用

由圖1可以看出，提取實驗所得的五味子黃酮對鄰苯三酚自氧化體系中所產生的·的清除作用略低于Vc，但仍表現出良好的抑制作用，其對·的清除率可達相同質量濃度Vc的90%，且其清除率隨著質量濃度的增加而明顯升高。

3.3.2 對·OH清除作用

按2.5.2的方法，對所得五味子黃酮進行·OH清除作用測定，結果如圖2所示。

圖2 五味子黃酮對·OH的清除作用

由圖2可以看出，所得五味子黃酮對Fenton反應體系中所產生的·OH的清除作用明顯高于相同質量濃度的Vc，為Vc的1.3倍，說明五味子黃酮對·OH有較強的清除作用。

3.4 五味子黃酮的抑菌性能

將實驗所得五味子黃酮干粉用少量65%乙醇溶解，再用蒸餾水稀釋成1、3、5、10mg／mL的溶液，采用平板－牛津杯抑菌法進行抑菌實驗，加樣量為200μL，結果表明，當樣品濃度為3mg／mL時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現出明顯的抑制作用，抑菌效果如圖3所示。

圖3 五味子黃酮抑菌效果圖

這與邊才苗［20］、許瑞波［21］等的研究結果一致，且抑菌效果隨著五味子黃酮濃度增大而明顯增強。

4 結 語

超聲波能有效地促進物質的溶解和擴散，超聲波法提取植物有效成分具有操作簡便，溫度低，時間短，且有效成分不易被破壞等優點，因此，廣泛應用于植物有效成分的提取研究中。五味子黃酮提取實驗結果表明，五味子黃酮的較優提取方法為超聲波輔助法，優化后的提取工藝條件為：超聲波功率300W、乙醇濃度65%，提取溫度45℃，提取時間20min，料液比1∶30（g／mL）。黃酮平均得率為41.25mg／g。

抑菌活性實驗表明，五味子黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，且抑菌效果隨著溶液濃度增大而顯著增強。

［1］ 曹衛國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用研究進展［J］.西 北 植 物 學 報，2003，23（12）：2241－2247.

［2］ 王軍妮，黃艷紅，牟志美，等.植物次生代謝物黃酮類化合物的研究進展［J］.蠶業科學，2007，33（3）：499－504.

［3］ Cao Wei－guo，Liu Zhi－qin，Shao Yun，et al.A progress in pharmacological research of flavonoids［J］.Acta Botanica Boreali－occidentalia Sinica，2003，23（12）：2241－2247.

［4］ Ammar R B，Bhouri W，Sghaier M B，et al.Antioxidant and free radical－scavenging properties of three flavonoids isolated from the leaves of rhamnus alaternaus a structure－activity relationship study［J］.Food Chem.，2009，116：258－264.

［5］ Ghasemzadeh A，Jaafar H Z E，Rahmat A.Antioxidant activities，total phenolics and flavonoids content in2varieties of Malaysia young ginger［J］.Molecules，2010，15：4324－4333.

［6］ Bent H Havsteen.The biochemistry and medical significance of the flavonoids［J］.Pharmacology ＆Therapeutics，2002，96（2）：67－73.

［7］ 劉繼永，王英平，劉洪章.五味子化學成分及藥理研究進展［J］.特產研究，2005（3）：51－55.

［8］ 郭冷秋，張鵬，黃莉莉，等.五味子藥理作用研究進展［J］.中醫藥學報，2006，34（4）：51－53.

［9］ 鄭春英，李宏濤，陸欣媛，等.五味子葉中總黃酮最佳提取工藝研究［J］.食品科學，2007，28（5）：139－142.

［10］ 石太淵，毛紅燕，馬濤，等.響應面法優化提取遼五味子黃酮工藝參數研究［J］.中國釀造，2011（2）：96－99.

［11］ 馬娜，郭宏旭，李俠，等.超聲波輔助提取北五味子黃酮類化合物的研究［J］.當代生態農業，2010（3）：144－148.

［12］ 馬濤，毛紅燕，石太淵，等.遼五味子黃酮純化及定性光譜分析［J］.食品與生物技術學報，2012，31（1）：101－105.

［13］ 鄒建國，劉飛，劉燕燕，等.響應面法優化微波輔助提取枳殼中總黃酮工藝［J］.食品科學，2012，23（2）：24－28.

［14］ 陳宗保，鄭大貴，葉青.微波輔助提取葛粉總黃酮及體外抗氧化性研究［J］.食品科技，2009，34（8）：131－134.

［15］ 陳宏銘，黃敏參，方玉霖，等.咸草總黃酮提取工藝的比較研究［J］.亞熱帶植物科學，2008，37（2）：35－37.

［16］ 張鳳清，張海月，謝叢林，等.從大豆豆芽中提取大豆異黃酮的工藝研究［J］.長春工業大學學報，2006，27（1）：65－68.

［17］ 史禮貌，解成喜.新疆大薊總黃酮的超聲提取及抗氧化性研究［J］.食品科學，2011，32（6）：120－123.

［18］ 李鵬婧，柳旭光，龍海榮，等.超聲波輔助提取菱角殼總黃酮及抗氧化性研究［J］.食品科技，2011，36（1）：167－171.

［19］ 劉冬梅，李理，楊曉泉，等.用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力［J］.食品研究與開發，2006，27（3）：110－111.

［20］ 邊才苗，楊云斌，費杰，等.五味子提取物體外抑菌作用初探［J］.浙江中醫藥大學學報，2009（1）：122－123.

［21］ 許瑞波，萬蓓蓓，高穎穎，等.北五味子葉總黃酮提取及生物活性［J］.食品科學，2013，34（20）：72－76.