葛根異黃酮對去卵巢大鼠血管內皮功能的保護作用

張寶榮，譚穎穎，張 琪

大量研究表明，婦女在絕經后失去雌激素對心血管的保護作用，心腦血管疾病發病率顯著增加［1］。雌激素替代療法對改善絕經后婦女的心血管疾病有效，但長期應用外源性激素，有增加子宮內膜癌、乳腺癌等發病率的危險［2］。藥理學研究表明葛根的主要有效成分異黃酮具有擴張血管，抑制血小板聚集和抗氧化等作用，其中葛根素、大豆甙和金雀異黃素等具有明顯的雌激素樣作用［3，4］。雌激素可通過影響內皮細胞功能而實現對心血管的保護作用［5］，但同樣具有雌激素活性的葛根異黃酮對絕經后婦女或雌激素缺乏動物內皮功能的影響尚未見有報道。本研究主要觀察了葛根異黃酮對去卵巢大鼠血管內皮功能的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 葛根異黃酮由陜西中醫學院新藥研究中心提供；去甲腎上腺素、乙酰膽堿和硝普鈉為Sigma公司產品；兔抗內皮型一氧化氮合酶（eNOS）一抗由Santa Cruz公司提供；Powerlab生物信號記錄系統為澳大利亞AD Instrument公司產品；雌二醇（E2）、內皮素（ET）和 一氧化氮（NO）檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗動物和分組 實驗選用雌性SD大鼠，體重250g～280g，適應性喂養1周后，隨機分成4組：假手術組（Sham）、卵巢切除組（OVX）、卵巢切除＋葛根異黃酮大劑量組（OVX＋TIPH）、卵巢切除＋葛根異黃酮小劑量組（OVX＋TIPL）。實驗動物由西安交通大學實驗動物研究中心提供。

1.3 去卵巢大鼠模型和給藥方法 大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，下腹部術區剪毛，仰臥位固定。嚴格消毒后，無菌條件下行下腹正中切口，逐層分離進入腹腔，辨別出雙側卵巢后，完整切除，并逐層縫合切口。假手術組大鼠行相同手術過程，但不切除卵巢。術后第3天，將卵巢切除大鼠隨機分為3組，給予藥物灌胃。大劑量和小劑量治療組分別給予葛根異黃酮150 mg／kg和50mg／kg，給藥體積為1mL／100g體重，時間為12周。對照組大鼠給予等體積生理鹽水。大鼠在溫度22℃，濕度30%～40%的環境中飼養，自由飲水和攝食。

1.4 血清學檢測 各組大鼠經以上藥物處理后，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，下腔靜脈取血，分離血清，使用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清雌二醇和內皮素含量。硝酸還原酶法檢測一氧化氮（NO）水平。以上試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 主動脈血管內皮功能的檢測 分離各組大鼠的主動脈，置于預冷的Kerb’s液中。將附著動脈的結締組織剝離后，切制為寬約3mm的動脈環形標本。在含Kerb’s液的37℃浴槽中，將動脈環懸掛，另一端連于張力換能器，并持續給予95%O2＋5%CO2的混合氣。張力換能器連接于Powerlab生物信號系統，記錄和分析動脈環張力變化情況。當動脈環穩定于基線后，浴槽中加入去甲腎上腺素（NE，106mol／L）收縮血管環，待動脈環收縮達平衡狀態后，分別加入濃度為（10－9～10－5）mol／L的內皮依賴性血管舒張劑乙酰膽堿（ACh），觀察血管的舒張反應。然后，洗脫血管，重新平衡至基線，改用累加濃度為10－9～10－5mol／L的非內皮依賴性血管舒張劑硝普鈉（SNP）重新舒張血管，測定各組非內皮依賴性血管舒張功能。

1.6 Western blot提取蛋白后Bradford法測定蛋白含量。上樣后，SDS－AGE凝膠電泳分離蛋白。電泳結束后，濕轉法將蛋白從聚丙酰胺凝膠轉移到硝酸纖維素膜。室溫下，脫脂奶粉（5%）封閉2h。兔抗內皮型一氧化氮合酶一抗（1∶500），4℃ 孵育過夜。TBS漂洗3次后，加入標記辣根過氧化物酶的IgG二抗，室溫孵育30min。漂洗3次膜后，在暗室里加入ECL顯色2min，并曝光膠片（1～2）min，采用圖像分析系統進行分析蛋白印跡結果。

1.7 統計學處理 計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，使用sigmastat 3.0軟件處理。

2 結 果

2.1 血清E2、ET和NO水平變化 卵巢切除12周后，OVX組大鼠的E2和NO水平較Sham組大鼠顯著降低（P＜0.01），ET水平顯著增高（P＜0.01）。術后給予葛根異黃酮干預后，OVX＋TIPL和OVX＋TIPH組大鼠的E2、ET和NO水平與OVX組間均有統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清E2、ET和NO水平變化（x±s）

2.2 血管舒張反應變化 在Sham組，加入濃度為（10－9～10－5）mol／L的內皮依賴性血管舒張劑乙酰膽堿后，動脈環呈現濃度依賴性舒張；而在OVX組，動脈環對乙酰膽堿的舒張反應出現顯著性障礙（P＜0.01）。給予葛根異黃酮干預后，與OVX組相比，OVX＋TIPL和OVX＋TIPH組的動脈環對乙酰膽堿的舒張反應顯著性增高（P＜0.05，見圖1A）。使用濃度為10－9～10－5mol／L的非內皮依賴性血管舒張劑硝普鈉舒張血管，各組血管環對硝普鈉的舒張效應無統計學意義（見圖1B）。

圖1 各組大鼠內皮依賴性血管舒張反應變化

2.3 內皮組織eNOS蛋白的表達變化 OVX組較Sham組大鼠eNOS表達顯著降低（P＜0.05），而OVX＋TIPL和OVX＋TIPH組與OVX組間均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 各組大鼠內皮組織eNOS蛋白的表達變化

3 討 論

血管內皮細胞是血管腔表面的單層上皮，形成血管的內壁。其不僅是循環血液與血管平滑肌間的屏障，也是人體重要的內分泌器官。血管內皮細胞受損是心血管疾病早期事件之一，也是多種心血管疾病形成的關鍵病理特征。在正常和受損狀態下，內皮細胞可分泌多種血管活性物質，如內皮素、血管緊張素Ⅱ、血栓素 A2、一氧化氮、前列環素、緩激肽等［5，6］。其中，一氧化氮和內皮素是關鍵的活性分子。動脈內皮功能受損時，一氧化氮的合成和釋放減少，內皮依賴性的舒張功能出現下降。用乙酰膽堿誘導的內皮舒張反應是評估血管內皮舒張功能的經典方法［7］。乙酰膽堿對正常的動脈表現為舒張反應，而在內皮功能受損時則出現舒張反應降低或出現收縮反應。本研究結果顯示，與對照組比較，去卵巢大鼠的內皮依賴性舒張反應顯著下降，而不同劑量的葛根異黃酮可以不同程度的改善受損的內皮依賴性舒張反應，其中150mg／kg葛根異黃酮作用較強。另外，L－NAME預處理可明顯阻斷葛根異黃酮對去卵巢大鼠血管的舒張反應，提示葛根異黃酮增加去卵巢大鼠主動脈血管的舒張反應依賴于一氧化氮。而血清檢測也發現，葛根異黃酮可以顯著增加去卵巢大鼠的一氧化氮水平，并降低內皮素的含量。這說明葛根異黃酮可以顯著改善去卵巢大鼠受損的內皮功能，具有保護血管內皮的作用。

雌激素受體可表達分布于動物和人的血管內皮細胞、平滑肌細胞［8］。雌激素替代治療可改善絕經期婦女血管內皮細胞的內分泌功能，調節血管的舒張功能，并可增加一氧化氮合酶的轉錄和表達，促進一氧化氮的合成和分泌，提高一氧化氮的活性。表明雌激素可以通過一氧化氮途徑改善受損血管內皮介導的舒張反應。已有研究發現異黃酮genistein和大豆黃酮等對雌激素受體的選擇作用比雌二醇高（2～10）倍左右，大豆黃酮是葛根異黃酮的成分之一［9］。因此葛根異黃酮可能通過雌激素受體直接影響動脈內皮功能。葛根異黃酮可以顯著增加去卵巢大鼠的雌激素水平。這說明葛根異黃酮改善內皮功能與其類雌激素樣作用有關。

本研究發現去卵巢大鼠的內皮細胞eNOS的表達降低，而葛根異黃酮可以上調異常的eNOS表達。eNOS表達于血管內皮細胞，可以在L－Arg和分子氧為底物下合成一氧化氮，調控內皮功能。該結果提示葛根異黃酮也可以通過直接或間接影響eNOS表達，發揮內皮保護效應。葛根異黃酮具有保護去卵巢大鼠血管內皮的功能，其機制與類雌激素樣作用、上調eNOS表達和降低內皮素水平等因素有關。

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