姜黃素調控Notch1信號通路誘導結腸癌SW480細胞株凋亡

劉少瓊，楊 芳，禹正楊，李春花，劉 婭，劉婉瑩

（南華大學附屬第一醫院，湖南 衡陽 421001）

姜黃素調控Notch1信號通路誘導結腸癌SW480細胞株凋亡

劉少瓊，楊 芳，禹正楊，李春花，劉 婭，劉婉瑩

（南華大學附屬第一醫院，湖南 衡陽 421001）

目的 從Notch1信號通路探討姜黃素誘導結腸癌SW480細胞株凋亡的分子機制。方法 （1）利用流式細胞技術檢測不同濃度姜黃素（0，7.5，15，30，60 μmol/L）處理結腸癌SW480株24 h和48 h后的細胞凋亡情況。（2）通過RT-PCR檢測不同濃度姜黃素（0，7.5，15，30，60 μmol/L）處理結腸癌SW480細胞株24 h和48 h后，Notch1信號通路中膜受體基因Notch1及下游靶基因Hes-1 mRNA表達情況，觀察姜黃素對Notch1信號通路中Notch1及Hes-1基因mRNA表達的影響。結果 （1）姜黃素能誘導結腸癌SW480細胞株凋亡；（2）姜黃素能一定程度上下調Notch1信號通路中Notch1及Hes-1基因mRNA的表達（P＜0.05）。結論 姜黃素能一定程度上誘導結腸癌SW480細胞株凋亡，這種對結腸癌SW480細胞毒性作用可能與調控Notch1信號通路中膜受體基因Notch1及下游靶基因Hes-1轉錄有關。

姜黃素；Notch1信號通路；結腸癌；SW480；細胞凋亡

腫瘤是當今世界第二大致死因素[1]，而結直腸癌是世界上第三常見惡性腫瘤，發病率在男性和女性患者中分別位居第三位和第二位[2]，并且結直腸癌在年輕人中發生率逐漸上升，年齡小于30周歲的年輕患者結直腸癌侵襲力更強、預后更差[3]。雖然，經規范聯合化療，可使結直腸癌病人5年生存率達42.7%，但世界上平均每年仍有60.8萬癌癥病人死于結直腸癌[4]；同時放化療給結直腸癌患者帶來明顯的毒副作用，嚴重影響了患者的生活質量，患者依從性差，因此尋找高效、低副作用的抗腫瘤藥物依然是研究者們的主攻課題。

傳統中醫藥在亞洲地區應用于治療惡性腫瘤有著悠久的歷史。姜黃素是由中藥姜黃根莖提取，目前研究顯示姜黃素對包括結直腸的多種腫瘤有抑制作用，此外它還具備抗炎、抗氧化、防衰老等作用，除了功效多外，其毒副作用小、耐受性好，是極具潛力的抗癌活性物質之一[5]，然而姜黃素抗結腸癌的分子機制尚未統一，因此有必要進一步探討。

Notch1信號通路在多種腫瘤（包括乳腺癌、腎癌、食管癌、前列腺癌及結直腸癌等）組織中檢測出過度表達，并且Notch1信號與這些腫瘤對化療藥物耐藥及腫瘤向周圍侵襲轉移相關[6-7]。Notch1信號通路在研究治療腫瘤分子機制中占有重要地位。

本文擬從Notch1信號通路探討中藥提取物姜黃素誘導結腸癌SW480細胞株凋亡的分子機制。

1 材料

1.1 細胞株、藥物與試劑

結腸癌SW480細胞株購于湘雅細胞中心 （中國，湖南長沙），無噬菌體胎牛血清購于四季青生物公司，RPMI-1640培養基購于Hyclone（美國），姜黃素粉末（J-007）購于成都瑞芬思生物科技有限公司（HPLC≥98.5%），cDNA逆轉錄試劑盒購于Thermo公司，DNA marker、2×Taq MasterMi（含染料）購于北京康為世紀生物科技有限公司，GoldView I型核酸染色劑均購于北京Solarbio公司，PBS粉末、總RNA提取試劑盒、流式細胞檢測試劑盒購于南京凱基生物公司，cDNA擴增引物由上海生工公司設計合成。

1.2 主要儀器

AIR-TECH醫用凈化工作臺 （蘇州蘇潔凈化設備公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴增儀（德國Roche Diagnostics公司）；Hema凝膠圖像分析儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；紫外分光光度計 （德國Eppendorf公司）；流式細胞儀 （美國BD FACSAria II）。

2 方法

2.1 細胞培養

含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，加1%青-鏈霉素雙抗，于5%CO2，37℃孵育箱中常規培養結腸癌SW480細胞株，1～2 d換液1次；待其貼壁生長融合至80%左右、細胞處于對數生長期時進行細胞傳代及種板。

2.2 藥物配制及實驗分組

姜黃素粉末溶于二甲基亞砜（DMSO），母液濃度為1 mol/mL，經0.22 μm無菌過濾器過濾后4℃冰箱避光保存，使用時用培養基稀釋成工作液，并使DMSO最終濃度＜0.01%。

實驗分組:根據濃度梯度姜黃素分為5組，即0（對照組）、7.5、15、30、60 μmol/L。處理時間:24 h和48 h。

2.3 流式細胞技術檢測SW480細胞凋亡

按照凱基Annexin-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作:將對數生長期細胞根據實驗分組加入含姜黃素培養基，處理24 h和48 h后分別收集細胞。用PBS洗滌細胞2次后分別加入500 μL的Binding Buffer液懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC溶液混勻后，加入5 μL碘化丙啶 （PI)，混勻；室溫、避光、反應5 min；使用美國BD FACSAria II流式細胞儀檢測。

2.4 RNA提取、逆轉錄及RT-PCR

2.4.1 總RNA提取步驟 對數生長期細胞經姜黃素處理分別24 h和48 h后，棄掉培養液，按照Solarbio總RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA，操作過程中均使用去酶的EP管和Tip頭，RNA提取后用紫外光分光光度計進行定量，測定樣品在260 nm和280 nm的吸光度，確定RNA質量。提取的總RNA進行逆轉錄。

2.4.2 逆轉錄及PCR引物擴增 按照Thermo逆轉錄試劑盒說明步驟進行逆轉錄。PCR引物擴增反應條件:95℃ 5min預變性，95℃變性30 s，按各自退火溫度退火30 s，延伸 72℃ 30 s，重復循環32次，最后延伸72℃ 5 min。

擴增引物序列見表1。

表1 PCR 31物擴增引物序列及反應條件

2.4.3 瓊脂糖凝膠電泳 稱取2 g瓊脂糖，移入三角瓶中加入1×TBE，置微波爐中加熱至溶液沸騰，自然冷卻至70～80℃時，加入EB替代物GoldView I型核酸染色劑，搖勻倒入模具中自然冷卻制成2%瓊脂糖凝膠，目的基因使用2%瓊脂糖凝膠，而內參β-actin使用1%瓊脂糖凝膠。制好的凝膠放入電泳槽中加入 1×TBE電泳液，每孔上樣 5 μL，DNAMarker加入5 μL，80 V恒壓電泳25 min，紫外燈下觀察結果。

2.5 統計方法

使用AlphaImager 2200圖像分析軟件對存入計算機的PCR產物電泳的圖像進行光密度掃描，目的基因產物光密度值/β-actin產物的光密度值為目的基因相對表達量（重復實驗3次）。所得實驗數據應用SPSS 18.0統計軟件進行分析，數據以采用One-Way ANOVA單因素方差分析法檢驗，結果以“±s”表示，P＜0.05代表差異有統計學意義。

3 結果

3.1 流式細胞技術檢測結腸癌SW480細胞株凋亡

流式細胞結果顯示姜黃素能誘導結腸癌SW480細胞株凋亡，當姜黃素濃度組為7.5 μmol/L和15 μmol/L時，與對照組0 μmol/L相比處于凋亡期細胞比例相差不大，而姜黃素濃度為60 μmol/L時，細胞處理 24 h位于Q2期細胞 （凋亡期）為56%，而處理48 h凋亡細胞可達94.4%。

3.2RT-RCR結果

當處理24 h時，姜黃素各濃度組Notch1基因mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05），而處理48 h時，60 μmol/L組與對照組 （0 μmol/L）相比，Notch1基因mRNA表達顯著降低（P＜0.05）（圖1，圖2）。當處理 24 h時，姜黃素各濃度組 Hes-1基因mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05），而處理48 h時，60 μmol/L組與對照組 （0 μmol/L）相比，Hes-1基因mRNA表達顯著降低（P＜0.05）（圖3，圖4）。姜黃素能一定程度上下調Notch1及Hes-1基因mRNA表達。

4 討論

結直腸癌是世界第三大常見腫瘤，其發生發展是由遺傳和生理改變多種因素共同作用而成，其主要分子機制尚未明確。在哺乳動物中，Notch信號主要由配體 （Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2)，受體（Notch 1-4）和相關靶基因:Hes和HERP等構成。Notch信號激活由臨近細胞配-受體結合后，受體蛋白水解，釋放胞漿內活性結構域（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細胞核，與核內轉錄因子結合，誘導Notch信號下游靶基因表達和轉錄[8]。

圖1 Notch1基因mRNA凝膠電泳圖

圖2 姜黃素對Notch1基因mRNA表達的影響

圖3 Hes-1基因mRNA凝膠電泳圖

圖4 姜黃素對Hes-1基因mRNA表達的影響

Notch1信號通路是Notch信號通路之一，它能在結直腸腫瘤組織中高表達并在結直腸癌發展過程中起致癌作用，不僅如此，Notch1在組織中高表達與病人總生存期短及預后差有關，可作為判斷預后和治療結直腸癌的潛力生物標記[9]。Hes-1基因是堿性螺旋—環—螺旋 （basic Helix-Loop-Helix，bHLH）基因家族的一個重要成員，Hes-1蛋白是bHLH基因的負性轉錄因子，通過與靶DNA或其他一些bHLH蛋白直接結合，切斷激活途徑，最終使轉錄無法進行，達到抑制細胞分化的目的。Hes-1蛋白作為Notch信號通路下游最重要的效應分子，在細胞的分化中具有重要的作用[10]。

姜黃素是中藥姜黃中提取的活性成分，臨床研究顯示它可作其他化療藥物（如紫杉醇、5-FU）的輔助用藥，不僅增強了抗癌效果、減少化療藥物的使用劑量[11]，而且還可減輕化療帶來的毒副作用，如皮膚損傷、腸道反應等[12]。并且姜黃素無明顯副作用，患者耐受性好。雖然較低的生物利用度一定程度上限制了姜黃素推廣使用，但經過研究者們的努力，通過改變其劑型或者通過結合一些金屬離子及特異性抗體形成雜交概念的姜黃素分子等，提高了它的生物溶解度及生物利用度[13]。

流式細胞結果顯示姜黃素能一定程度上誘導結腸癌SW480細胞株凋亡。RT-PCR方法檢測到姜黃素能一定程度下調結腸癌SW480細胞株中細胞膜受體基因Notch1及下游靶基因Hes-1的mRNA表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究團隊前期研究顯示姜黃素能夠一定程度上抑制結腸癌SW480細胞株中與Notch1信號通路相關蛋白，如Notch1受體蛋白和下游靶蛋白Hes-1的表達[14-15]，從蛋白翻譯水平闡述姜黃素對Notch1信號通路的調節作用，本文從基因轉錄水平對姜黃素調控Notch1信號通路進行補充。Notch1信號通路在人結直腸癌組織中起致癌作用，姜黃素能下調Notch1信號通路而誘導結腸癌SW480細胞株凋亡，但是Notch1信號通路是由多個元件構成，其下游有多個靶基因，并且靶基因之間關系復雜，本研究僅從Hes-1單個靶基因進行探討姜黃素對Notch1信號通路調節作用有一定的局限性，我們期望在后續研究中找到姜黃素調控Notch1信號通路的最終靶位基因，并深入探討其與Hes-1靶基因之間的關系。

同時姜黃素誘導結腸癌細胞株凋亡并不是通過單一分子機制完成的，姜黃素調控Notch1信號通路可能是分子機制之一。本研究僅為姜黃素治療結直腸腫瘤提供理論參考，更深入探討姜黃素抗腫瘤的分子機制仍然是未來抗癌研究方向。

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（本文編輯 楊 瑛）

Curcumin Promoting Apoptosis of Colon Cancer Cell line SW480 by Regulating Notch1 Signal Pathway

Shao-Qiong Liu,Fang Yang,Zheng-Yang Yu,Chun-Hua Li,Ya Liu,Wan-Ying Liu
(The First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To investigate molecular mechanism of curcumin in promoting apoptosis of colon cancer cell line SW480 through Notch1 signal pathway.Methods (1)The apoptosis of colon cancer cell line SW480 treated by diverse concentrations of curcumin(0，7.5，15，30，60 μmol/L)for 24 hours and 48 hours were tested by flow cytometry method.(2) The mRNA expressions of gene Notch1 and gene Hes-1 in Notch1 signal pathway of colon cancer cell line SW480 were detected by RT-PCR,which was treated by diverse concentrations of curcumin(0，7.5，15，30，60 μmol/L).Results(1) Curcumin could promote apoptosis of colon cancer cell line SW480.(2)Curcumin could decrease mRNA expressions of gene Notch1 and gene Hes-1 of colon cancer cell line SW480(P＜0.05).Conclusion Curcumin could accelerate apoptosis of colon cancer cell line SW480,and the effect of anticancer may be associated with regulating mRNA expressions of gene Notch1 and Hes-1 in Notch 1 signal pathway.

curcumin;Notch1 signal pathway;colon cancer;SW480;apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.005

2015-05-07

湖南省自然科學基金資助項目（11JJ6083）。

劉少瓊，女，主任醫師，副教授，碩士研究生導師，E-mail:liushaoqiong861224＠126.com。