姜黃素治療大鼠角膜堿燒傷的實驗研究

李 妍，秦 莉，李晶明

（1.陜西省西安市第四醫院眼科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學第一附屬醫院眼科，陜西 西安 710061）

姜黃素治療大鼠角膜堿燒傷的實驗研究

李 妍1，2，秦 莉2，李晶明2

（1.陜西省西安市第四醫院眼科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學第一附屬醫院眼科，陜西 西安 710061）

目的 觀察姜黃素對大鼠角膜堿燒傷新生血管（CNV）的抑制作用和對CD11b及角膜上皮凋亡細胞表達的影響，初步探討其治療角膜堿燒傷的作用機制。方法 選用雄性SD大鼠24只，隨機分為4組（每組6只）：A組為空白組，B組為模型組，C組為姜黃素組，D組為二甲基亞砜（DMSO）組。除空白組外，采用氫氧化鈉眼內燒傷造模，并予相應干預，第3、7、10、14天裂隙燈下觀察角膜CNV形態并眼前節照相記錄CNV長度，計算CNV面積，進行統計學分析；通過H-E染色法觀察角膜病理形態學變化；免疫組化法觀察CD11b表達；TUNEL染色法檢測角膜上皮細胞凋亡表達。結果 裂隙燈下觀察B組和D組CNV生長旺盛，管腔粗大，C組CNV稀疏管腔細小；3 d時三組CNV面積分析差異無統計學意義(P＞0.05)，7、10、14 d時CNV面積比較C組CNV面積顯著降低(P＜0.05)；H-E染色B組和D組角膜基質層內大量的CNV管腔和血細胞，C組基質層偶見CNV，管腔細小；A組CD11b、角膜上皮凋亡細胞在角膜僅少量表達，B組和D組CD11b在基質層新生血管內壁上高表達，角膜上皮層凋亡細胞高表達，C組CD11b低表達，角膜上皮層凋亡細胞低表達。結論 姜黃素能有效的抑制大鼠角膜堿燒傷CNV治療角膜堿燒傷，通過下調CD11b抗炎和下調角膜上皮凋亡細胞抗凋亡發揮作用。

姜黃素；角膜堿燒傷；新生血管；CD11b；角膜上皮層細胞；凋亡

角膜堿燒傷是眼外傷中一種嚴重的致盲性眼病。在我國，嚴重的角膜化學傷引起的角膜新生血管（CNV）占整個角膜疾病的10%。堿性化學物質發生皂化作用很快穿透眼組織，引起角膜新生血管、潰瘍等導致視力喪失。目前治療角膜堿燒傷的方法多種多樣，但仍缺少一種有效、經濟、安全的臨床藥物。姜黃素是我國的一種傳統草藥提取物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[1]以及誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡[2]。安全性高毒性小，易溶于乙醇、二甲基亞砜（DMSO），微溶于水，近年來在眼科領域成為研究熱點，研究表明姜黃素通過下調血管內皮生長因子(VEGF)的表達抑制新生血管[3]、通過抗增殖、抗纖維化誘導細胞凋亡治療青光眼濾過瘢痕和翼狀胬肉等[4]。2008年蘇凡凡[5]研究姜黃素能抑制大鼠角膜堿燒傷CNV，但未探討作用機制，同年胡靜[6]探討姜黃素治療大鼠角膜堿燒傷是通過調控角膜超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）抗氧化作用機制實現的，近年來有關姜黃素治療角膜堿燒傷的作用機制研究甚少，本實驗在這些研究基礎上進一步觀察姜黃素抑制大鼠角膜堿燒傷的CVN，并通過檢測姜黃素對炎性指標CD11b表達和角膜上皮細胞凋亡的影響，進一步探討其作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器和試劑

裂隙燈顯微鏡，眼前段照相系統（日本CANON公司），石蠟組織切片機（德國LEIKA公司）；兔抗大鼠CD11b多克隆抗體 （Abcom公司），SP免疫試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），TUNEL試劑盒（Roche公司），Whatman 3#濾紙（美國SIGMA公司），98.5%姜黃素原料藥粉劑（50g/瓶，sigma公司），DMSO（上海榕柏生物技術有限公司），氫氧化鈉、蘇木素溶液和伊紅溶液（西安生物化學試劑廠），TritonX-100和Tween-20(上海艾研生物科技有限公司)。

1.2 姜黃素的配制[7]

147 mg的姜黃素溶于10 mL的DMSO溶液中，濃度為40 mmol/L，按每管25 μL分裝，避光保存于-20℃冰箱中，結膜下注射前以生理鹽水按1∶1000稀釋，現用現配。

1.30.1%DMSO試劑配制

0.1 mL的DMSO溶于100 mL的生理鹽水中，4℃保存。

2 方法

2.1 造模與分組

清潔級健康無眼疾的成年雄性SD大鼠24只，購自西安交通大學動物中心，體質量（230±60）g，合格證號:0034325，許可證號:SCXK-(陜)2007-001，采用隨機數字分組法分為4組 （每組6只）:A組為空白組，不給予任何處理；B組為模型組；C組為姜黃素組；D組為DMSO組，每組右眼為實驗眼。B組、C組和D組動物分別用10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，以直徑3 mm的圓形濾紙片浸入1 mol/L NaOH溶液中20 s，置于干燥濾紙上吸除多余的堿液，均勻地貼于大鼠右眼角膜中央40 s，取下濾紙后生理鹽水迅速沖洗1 min制造大鼠角膜堿燒傷模型[8]。

2.2 干預

B組結膜下注射生理鹽水0.1 mL，C組結膜下注射濃度為40 μM姜黃素溶液0.1 mL，D組結膜下注射0.1%DMSO 0.1 mL，各組結膜下隔天注射1次，共注射7次。

2.3 觀測指標

2.3.1 CNV面積計算 分別在第3、7、10、14天裂隙燈下觀察大鼠角膜CNV形態改變，同時進行眼前段照相，記錄CNV長度（以連續且彎曲度小，并與角膜緣切線垂直的新生血管長度為準）計算CNV面積。計算CNV面積公式[9]:

S為CNV生長面積，C為CNV網的跨圓周鐘點數，r為角膜半徑，l為新生血管長度。

2.3.2 CD11b表達及上皮細胞凋亡的檢測 第14天頸椎脫臼處死所有實驗大鼠，迅速摘取完整右眼球，顯微角膜剪眼球后壁剪開約1 mm直徑的小口，1 mL的注射器針頭從小口刺入至角膜內皮層后，置15%中性甲醛溶液中固定48 h。眼球依次采用濃度梯度乙醇脫水，浸蠟包埋，采取矢狀面切片，切片厚度4 μm。

（1）H-E染色觀察角膜病理形態學改變:石蠟切片常規蘇木精-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片后光鏡下觀察角膜形態學變化。（2）免疫組化（S-P法）觀檢測CD11b:石蠟切片常規脫蠟完成水化，采用過氧化氫室溫孵育，抗原修復，山羊血清封閉切片，滴加1∶10稀釋的兔抗大鼠CD11b一抗過夜后，滴加生物素標記的二抗孵育，再滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，用DBA顯色試劑盒顯色蘇木精核復染，自來水沖洗返藍，乙醇依次脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，以PBS代替一抗作空白對照，觀察CD11b表達。（3）TUNEL染色檢測角膜上皮細胞凋亡:石蠟切片常規脫蠟完成水化，PBS洗滌3次，置于0.1%冰檸檬酸鈉溶液冰上通透5 min，用PBS液沖洗2次，組化筆標記組織后加入20 μL的TUNEL混懸液，避光孵育1 h，沖洗封片。（4）數據平均光密度計算:每組各取6張切片，選取3個背景良好的視野區照相，CD11b染色結果采用Image ProPlus6彩色圖像分析軟件，分析每張圖片中角膜組織區域的積分光密度（IOD）和面積（area），計算平均光密度值（IOD/area）。（5）凋亡率的計算:隨機選取TUNEL染色角膜上皮細胞中3個高倍鏡視野，計算角膜上皮凋亡細胞和和角膜上皮細胞總數，角膜上皮細胞凋亡率=角膜上皮凋亡細胞數/角膜上皮細胞總數×100%。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 CNV形態觀察和CNV面積比較

如圖1所示:裂隙燈下觀察空白組，角膜透亮，無CNV；第3 d時各組均睫狀充血，角膜堿燒傷區水腫明顯，堿燒傷斑明顯，角鞏膜緣處新生血管芽呈刷狀長出，三組CNV形態表現基本相同；7 d時模型組和DMSO組角膜新生血管生長旺盛致密，頂端分叉，接近堿燒傷區，堿燒傷區水腫明顯；姜黃素組CNV頂端分叉稀疏，血管管腔細，未達到堿燒傷區，部分鐘點位無新生血管，堿燒傷區水腫程度輕。10 d時模型組和DMSO組CNV致密呈網狀，血管筆直，管腔粗大，范圍廣泛，頂端到達角膜中央交織，堿燒傷區灰白色水腫；黃素組CNV稀疏，開始退化，血管影可見，管腔細，堿燒傷區清亮。14 d時模型組和DMSO組CNV仍粗大致密，達到高峰開始消退；姜黃素組CNV大部分消退萎縮至堿燒傷區外，角膜大部分鐘點位無CNV，血管管腔狹小，角膜上皮光滑。

如表1所示，角膜堿燒傷3 d時CNV面積比較組間差異無統計學意義（P＞0.05)。7 d、10 d和14 d時CNV面積比較組間差異有統計學意義（P＜0.05)。C組CNV面積顯著降低，比較差異有統計學意義（P＜0.05)。

3.2 14 d各組病理形態學觀察

如圖2所示，14 d時A組H-E染色角膜5層結構清晰、完整，基質層無水腫增厚，見排列整齊的膠原纖維，未見新生血管腔；B組和D組角膜組織水腫增厚，基質層纖維排列紊亂，可見大量的CNV管腔、血細胞和炎性細胞，管腔粗大；C組角膜上皮趨于光滑平整，基質層水腫減退，厚度基本接近A組，基質層CNV消退減少，管腔狹小。

圖1 角膜新生血管7、10、14 d形態觀察

表1 大鼠角膜堿燒傷新生血管面積（±s，n=6，mm2）

表1 大鼠角膜堿燒傷新生血管面積（±s，n=6，mm2）

注:與模型組（B組）和DMSO組（D組）比較#P＜0.05；模型組（B組）和DMSO組（D組）比較P＞0.05。

組別B組C組D組F P 3 d 8.25±1.33 8.00±1.09 8.05±1.26 0.07 0.93 7 d 19.59±1.69 14.22±1.59#19.40±2.29 15.73＜0.05 10 d 23.14±1.77 15.54±3.39#22.27±2.34 8.86＜0.05 14 d 21.31±2.64 12.25±4.03#20.21±2.02 21.67＜0.05

圖2 大鼠角膜堿燒傷光鏡圖（HE染色×100）

3.3 各組CD11b表達的比較

如圖3所示，14 d時A組大鼠角膜上皮層和內皮層CD11b微量表達，B組和D組CD11b棕黃色顆粒增多，染色顆粒顏色增強，主要定位于角膜上皮層、基質層的新生血管內皮層，C組CD11b染色接近A組，棕黃色顆粒減少，染色顆粒顏色減弱，基質層CNV內壁染色顆粒減少。

圖3 大鼠角膜堿燒傷基質層CD11b免疫組化顯微圖（×50）

CD11b表達比較，B組CD11表達顯著高于A組（P＜0.05），C組CD11b表達顯著低于B組和D組（P＜0.05），而D組與B組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

3.4 各組角膜上皮細胞凋亡的比較

14 d時A組見角膜上皮層下方細胞核黃棕色著染的凋亡細胞，B組角膜上皮層細胞核胞漿均黃棕色著染，出現大量的凋亡細胞，C組角膜上皮層下方可見凋亡細胞，上皮層細胞核仍藍染，和A組相似，D組角膜上皮細胞核細胞漿均黃棕色著染，出現大量的凋亡細胞，和B組相似。見圖4。

圖4 大鼠角膜堿燒傷角膜上皮細胞凋亡顯微圖（TUNEL染色×50）

角膜上皮凋亡細胞表達比較，B組角膜上皮凋亡細胞表達顯著高于A組 （P＜0.05），C組角膜上皮凋亡細胞表達顯著低于B組（P＜0.05），而D組與B組比較，角膜上皮凋亡細胞差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠角膜CD11b平均光密度值和角膜上皮凋亡細胞凋亡率 （±s）

表2 各組大鼠角膜CD11b平均光密度值和角膜上皮凋亡細胞凋亡率 （±s）

注:與A組比較*P＜0.05；C組和B組、D組比較#P＜0.05，D組和B組比較P＞0.05。

組別A組B組C組D組 F P n 6 6 6 6平均光密度值（IOD/area）CD11b 0.007 6±0.000 6 0.031 9±0.002 5* 0.016 4±0.001 0#0.032 5±0.002 4 164.365 0＜0.05凋亡率（%）TUNEL 9.01±2.17 72.31±13.25* 12.34±3.10#75.72±11.14 58.40＜0.05

4 討論

角膜過多的CNV破壞了角膜的微環境和透明性，成為臨床上致盲的主要原因之一。CNV的形成機制復雜，VEGF學說是CNV目前公認的主要機制之一，戴鵬飛等[10]實驗證明大鼠角膜堿燒傷后VEGF的表達和CNV的變化成正相關，林小俊[3]實驗表明姜黃素能顯著減少VEGF的表達抑制CNV。目前臨床上尚缺乏理想的抑制CNV的藥物，糖皮質激素能抗炎抑制CNV，但眼部使用副作用大，不能在眼表長期安全使用。美國上市的抗VEGF藥物貝伐單抗（Avstain）能抑制CNV，但其價格昂貴，主要用于腫瘤內科，眼科使用受限。有研究表明姜黃素整體抗CNV的能力并不輸于Avastin[11]。本實驗中14 d時C組CNV比其它組在數量、長度和范圍上減少，CNV面積減少，H-E染色觀察C組角膜上皮光滑，基質層水腫輕，CNV數量少，證明姜黃素能有效地抑制大鼠角膜堿燒傷CNV。

角膜堿燒傷刺激大量的多形核白細胞（PMN）和炎性介質釋放，發生急性炎癥反應，中性粒細胞黏附因子CD11b在正常情況下低表達，但在炎癥急性期大量表達，對白細胞等炎癥細胞的遷移、聚集和趨化起著重要的作用，被認為是炎癥反應的重要標志。正常的角膜組織中不同程度的存在著各種黏附分子，但均少量表達。整合素家族是黏附家族的重要成員之一，參與調控炎癥期PMN的吸附、滲出和遷移[12-13]，CD11b/CD18是巨噬細胞分化抗原 1（Mac-1）——作為整合素家族中重要的膜蛋白，對PMN的調控作用顯著，CD11b也就成為抑制機體炎癥時加以阻斷的重要靶點，使得多種因素可調控CD11b的表達[14]。近年有研究表明CD11b的高表達是重癥肺炎患兒中性粒細胞的判斷依據[15]、干預CD11b的表達可以減輕膿毒癥大鼠的炎性反應等[16]。角膜堿燒傷早期PMN和淋巴細胞侵入病變區域，2周至3周時大量的PMN浸潤，外界刺激改變了CD11b的構象，激活P53-MARK信號通路介導PMN等迅速到達感染部位發揮效應。本實驗中A組CD11b僅微量表達，在堿燒傷炎癥期CD11b在基質層和基質層新生血管內皮上高表達，證實了CD11b代表了炎癥細胞，C組下調了CD11b的表達，為姜黃素通過抗炎作用機制治療角膜堿燒傷奠定了理論依據。

細胞凋亡是生理性的，亦是病理性的。正常的角膜上皮細胞僅有少量的細胞凋亡維持生理代謝，角膜堿燒傷時炎癥反應和細胞凋亡是同時存在的。角膜堿燒傷時眼表的炎癥因子和促凋亡因子激活凋亡通路，同時產生大量的PMN和炎性細胞，過多的吞噬角膜壞死組織發生呼吸爆破，生成大量的活性氧簇 （ROS），ROS可以通過細胞氧化應激反應損傷細胞DNA，誘導細胞凋亡[17]。但也有研究表明姜黃素存在雙向濃度調控，高濃度的姜黃素能顯著增加細胞中的活性氧，激活線粒體凋亡途徑，誘導細胞產生ROS，促進腫瘤細胞凋亡[18]。因此，姜黃素給藥濃度的摸索是至關重要的。本實驗中TUNEL染色角膜上皮細胞核染黃褐色顆粒的為陽性表達，B組角膜上皮細胞胞核和胞漿均黃褐色深染，C組姜黃素干預后角膜上皮層凋亡細胞減少，結果為姜黃素通過抗凋亡作用機制治療角膜堿燒傷奠定實驗基礎。

姜黃素作為一種中藥，具有多途徑治療疾病的特點，能有效地抑制角膜堿燒傷CNV，通過下調CD11b表達抗炎、抗角膜上皮細胞凋亡發揮治療角膜堿燒傷作用，為臨床治療角膜堿燒傷提供新的理論依據，但其調控通路和作用機制仍不明確，需要從多途徑、多層面的基礎研究進一步探討。

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（本文編輯 楊 瑛）

Study of Curcumin in Treating Corneal Alkaline Burn of Rats

Yan Li1,2,Li Qin2,Jing-Ming Li2
(1.Department of Ophthalmology,the Fourth Hospital of Xi'an City,Xi'an,Shanxi 710004,China;
2.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an,Shanxi 710061,China)

Objective To study the inhibition of curcumin on corneal neovascularization(CNV)in the corneal alkaline burned rats,and the effect on CD11b and corneal epithelium apoptosis.Then investigate its mechanism on treatment of corneal alkaline burn.Methods 24 male SD rats were randomly divided into 4 groups(6 rats in each group):Group A was the blank control group,Group B was the model group,Group C was the curcumin group,and Group D was the DMSO group.Except for the blank group,the other groups were modeled by sodium hydroxide to induce the burn in eyes and with the corresponding intervention.On the 3th day,7th day,10th day and 14th day,CNV was observed and taken photos with slit-lamp microscope.The CNV area was calculated accordingly,and all data were analyzed statistically.The pathological change was observed by H-E staining; the expression of CD11b in corneal was detected with immunohistochemical method;the corneal epithelial cell apoptosis was detected by TUNEL staining.Results The CNV of Group B and Group D was vigorous,its lumen was wider,CNV of Group C was scattered and small;The CNV area of three groups at 3th day was not statistically different (P＞0.05);The CNV area of Group C was decreased significantly at 7th, 10th,14th day (P＜0.05).After HE staining,there were amount of lumen of CNV and haemocytes in the stromal layer,CNV of group C was few and with small lumen.CD11b and TUNEL cells of Group A were lowly expressed in epithelium of cornea;CD11b of Group B and D in the CNV wall and corneal epithelium apoptosis were highly expressed,while that in Group C were with low expression.In B group,they were obviously expressed and had statistically significant conversely.Compared with B group,they were lower in C group.The expression level between D group and B group was no significant different.Conclusion Curcumin could inhibit CNV effectively in the corneal alkaline burned rats to antiinflammatory and anti-apoptosis effects through down regulating CD11b and corneal epithelium apoptosis.

curcumin;corneal alkaline burn;corneal neovascularization;CD11b;corneal epithelium;apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.006

2015-01-30

陜西省科技攻關計劃資助項目（2011k1402-04）。

李 妍，女，碩士，主治醫生，研究方向:眼表疾病，白內障。