苦瓜多糖微波輔助提取工藝及其抗氧化活性

張偉豐，王 亮

（新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830066）

苦瓜（Momordica charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬一年生蔓性草本植物的果實(shí)，又名涼瓜、癩瓜等[1].苦瓜中含有多種化學(xué)成分，諸如苦瓜素、苦瓜皂苷、苦瓜凝集素、多糖等，國(guó)內(nèi)外對(duì)苦瓜多糖（Polysaccharides from Momordica charantia L.，MCLP）研究較少，主要集中在苦瓜多糖的熱水提取[2]、酶法協(xié)同提取[3]、降血糖活性[4]、抗腫瘤及免疫活性[5]等初步研究方面，但關(guān)于微波協(xié)同輔助提取苦瓜多糖工藝鮮見報(bào)道.為此，本文探討苦瓜多糖微波輔助提取工藝，并探討其抗氧化活性，旨在為苦瓜多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜（市售）；乙醇、苯酚、濃硫酸、鹽酸、FeSO4、水楊酸等均為分析純；鄰苯三酚、葡萄糖（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（Sigma公司）

1.2 主要儀器

200 g手提式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；G2X-GFC型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TGL-16GA型冷凍高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（上海預(yù)康科教儀器設(shè)備有限公司）；RE-52X型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；LGI-10冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物股份有限公司）；722可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）.

1.3 方法

1.3.1 苦瓜的預(yù)處理

將苦瓜洗干凈去籽之后，切成薄片，置于干燥箱中70℃干燥48 h，粉碎待用.

1.3.2 苦瓜多糖提取工藝流程

苦瓜粉→微波輔助提取→離心→上層清液→濃縮→粗多糖溶液→醇析→沉淀→干燥→苦瓜多糖.

1.3.3 多糖含量的測(cè)定及提取率計(jì)算

多糖含量采用改良的苯酚-硫酸法[6]，提取率計(jì)算按照下列公式：

多糖提取率=粗多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

1.3.4 苦瓜多糖微波提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

（1）液料比對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g苦瓜粉末，在微波功率為50 W，提取時(shí)間為10min的條件下，考察不同液料比（20，30，40，50，60）（mL/g）對(duì)苦瓜多糖提取率的影響.

（2）微波功率對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g苦瓜粉末，在液料比20：1，提取時(shí)間為10 min的條件下，考察微波功率（40，50，60，70，80 W）對(duì)苦瓜多糖提取率的影響.

（3）提取時(shí)間對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g苦瓜粉末，在料液比20：1，微波功率為50 W的條件下，考察提取時(shí)間（5，10，15，20，25 min）對(duì)苦瓜多糖提取率的影響.

1.3.5 苦瓜多糖微波輔助提取的正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)微波功率（A）、液料比（B）和提取時(shí)間（C）的3因素3水平正交試驗(yàn)，以苦瓜多糖的提取率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而選出最佳水平的組合，得出苦瓜多糖微波輔助提取法的最佳工藝參數(shù).

1.3.6 苦瓜多糖的抗氧化活性

（1）對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用[7]

以8.8 mmol/L H2O21 ml、9 mmol/L FeSO4l ml、9 mmol/L水楊酸-乙醇1 ml、不同濃度的多糖溶液1 ml構(gòu)成反應(yīng)體系，最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，在37℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測(cè)量各濃度的吸光度.考慮到多糖本身的吸光值、以9 mmol/L FeSO4l ml、9 mmol/L水楊酸-乙醇1 ml、不同濃度的多糖溶液1 ml和1 ml蒸餾水作為多糖的本底吸收值，按照下列公式計(jì)算清除率：

清除率=[1-（AX-AX0）/A0]×100%

其中，A0：空白對(duì)照液的吸光度；AX：加入多糖溶液后的吸光度；AX0：不加顯色劑H2O2多糖溶液本底的吸光度.

（2）對(duì)超氧自由基（O2－）的清除作用[8]

取4.5 ml 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）和4.2 ml蒸餾水，混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入到25℃預(yù)熱過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 ml（以10 mmol/L HCl配制，空白管用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，325 nm下每隔30 s測(cè)定吸光度，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加，按照下列公式計(jì)算清除率.

清除率=（△A0－△A）/△A0×100%

其中，△A0：鄰苯三酚的自氧化速率；△A：加入多糖溶液后鄰苯三酚的自氧化速率.

（3）對(duì)DPPH自由基的清除作用[9]

取2 mL不同濃度的樣品多糖溶液與0.1 mmol/L DPPH自由基溶液2 mL，充分搖勻后在室溫下靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，按照下列公式計(jì)算清除率：

清除率=[1-（AX-AX0）/A0]×100%

其中，A0：2 mL乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度；AX：2 mL樣品液加2 mL DPPH溶液的吸光度；AX0：2 mL樣品液加2 mL乙醇的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

由圖1可以看出，苦瓜多糖的提取率隨溶劑的增加而增加，當(dāng)液料比大于40：1（mL/g）后，多糖提取率的增加趨勢(shì)較為平緩.從節(jié)約原料和溶劑的角度考慮，選用液料比40：1（mL/g）比較合適.

圖1 液料比對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

2.2 微波功率對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

由圖2可知，苦瓜多糖提取率隨著微波功率的升高先增加后減小，當(dāng)微波功率達(dá)到60 W時(shí)，多糖提取率出現(xiàn)峰值.這可能是因?yàn)楣β试礁撸瑴囟仍礁撸苄远嗵堑臄U(kuò)散速度就越快，使有效成分更快浸出.但在微波功率大于60 W時(shí)，多糖的提取率有所降低，可能是因?yàn)楣β实纳邔?dǎo)致溫度的升高，使苦瓜中其他的水溶性物質(zhì)一起浸出，從而抑制了多糖的浸出，導(dǎo)致多糖的提取率下降.因此，微波功率選擇60 W為宜.

圖2 微波功率對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

2.3 提取時(shí)間對(duì)苦瓜多糖提取率的影響

從圖3中可以看到，隨著提取時(shí)間的增加，苦瓜多糖的提取率變化情況是先增加后減小，提取時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，多糖提取率出現(xiàn)又一個(gè)峰值.其中的原因可能是苦瓜多糖的提取率與提取時(shí)間有很大關(guān)聯(lián)，時(shí)間過(guò)短，多糖溶解不充分，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)15 min時(shí)，多糖的提取率又逐漸減小，這說(shuō)明提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致提取率降低.因此，提取時(shí)間選擇15 min.

2.4 提取工藝的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定液料比、微波功率和提取時(shí)間為苦瓜多糖提取率的主要影響因素，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)表見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

從表2中的極差R值能夠看出，三個(gè)因素對(duì)苦瓜多糖提取率的影響程度為B＞A＞C，并且液料比影響程度最大，其次是微波功率，影響最小的是提取時(shí)間.所以最佳提取組合條件為A2B3C3，即液料比為50：1（mL/g），微波功率60 W，提取時(shí)間為20 min.在最佳工藝條件下微波輔助提取苦瓜多糖的提取率為10.05%.

圖3 提取時(shí)間對(duì)苦瓜多糖多糖提取率的影響

2.5 苦瓜多糖的抗氧化活性

2.5.1 對(duì)羥基自由基的清除作用

苦瓜多糖對(duì)羥基自由基的清除作用見圖4，從圖4可以看出，在供試的濃度范圍內(nèi)，苦瓜多糖具有顯著的清除·OH的能力，清除效果隨著多糖濃度的增加而上升，并且有一定的量效關(guān)系.多糖濃度為2.5 mg/mL時(shí)清除率最高，達(dá)到63.68%，表明苦瓜多糖清除羥基自由基能力較高.

2.5.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

苦瓜多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用見圖5，從圖5可以看出，在供試的濃度范圍內(nèi)，苦瓜多糖具有顯著的清除超氧陰離子的能力，隨著多糖濃度的增加，清除超氧陰離子的作用不斷增強(qiáng)，且有一定的量效關(guān)系.當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到59.24%，表明苦瓜多糖清除超氧陰離子能力較高.

表1 苦瓜多糖提取工藝的正交試驗(yàn)因素與水平

圖4 苦瓜多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

圖5 苦瓜多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

2.5.3 對(duì)DPPH自由基的清除作用

苦瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖6，從圖6可看出，在供試的濃度范圍內(nèi)，苦瓜多糖具有顯著的清除DPPH的能力，隨著多糖濃度的增加，清除DPPH作用不斷增強(qiáng)，且有一定的量效關(guān)系，當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到42.54%.

表2 微波輔助提取苦瓜多糖的L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=3）

圖6 苦瓜多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

3 結(jié)論

（1）確定微波輔助提取苦瓜多糖的最佳工藝為：液料比為50：1（mL/g），微波功率60 W，提取時(shí)間20 min.在最佳工藝條件下微波輔助提取苦瓜多糖的提取率為10.05%.

（2）苦瓜多糖具有較強(qiáng)的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基作用，且隨著多糖濃度的增加，清除作用不斷增強(qiáng)，具有一定的量效關(guān)系.當(dāng)苦瓜濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率分別達(dá)到63.68%、59.24%和42.54%.

[1]吳周和，鄒沛，徐燕.苦瓜和苦丁茶的抑菌作用及其袋泡茶的研制[J].飲料工業(yè)，2003（5）：11-13.

[2]劉金福，張平平，趙鑫.苦瓜多糖提取工藝的研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，10（3）：30-34.

[3]張利芳，張名位，黃文，等.纖維素酶協(xié)同超聲波輔助提取苦瓜多糖工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2010，41（11）：142-147.

[4]董英，張慧慧.苦瓜多糖降血糖活性成分的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，30（1）：54-56.

[5]蔡寅，劉敏，吳勛貴，等.苦瓜多糖抗腫瘤及免疫增強(qiáng)活性的研究[J].藥學(xué)與臨床研究，2010，18（2）：131-134.

[6]徐斌，董英，林琳，等.改良苯酚-硫酸法測(cè)定苦瓜多糖含量[J].食品科技，2005（7）：79-82.

[7]陳留勇，孟憲軍，賈薇，等.黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究[J].食品科學(xué)，2004，25（1）：167-170.

[8]李雪華，龍盛京.木耳多糖的提取與抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué)，2001，22（3）：26-29.

[9]韋霽，盧家炯，莫海濤，等.甘蔗汁提取物抗氧化活性初步研究[J].廣西輕工業(yè)，2006，22（1）：11-13.