搖蚊幼蟲存活條件優(yōu)化

徐建榮，蔣金成，曹 昆 ，李 明 ，韓曉磊

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

搖蚊幼蟲（Chironomid Larvae）又名血蟲，在各類水體中都有廣泛分布，其生物量常占水域底棲動物總量的50%～90%，是多種經濟水生動物的優(yōu)良天然餌料.世界上已知的搖蚊科昆蟲約有5000種，中國最早的搖蚊記錄是Wiedemann于1828年記載的Chironomus venastus.其蛹羽化后的成蟲與常見的蚊類成蟲比較相似，但主要的不同在于觸角上密生細毛，如羽毛狀，其次是它的口器（口針）已退化，不具吸食的功能[1-3].搖蚊生長快，繁殖力強，適宜人工培育.日本學者代田昭彥利用有機泥和下水道淤泥進行流水培養(yǎng)實驗.獲得每平方米活體質量為800 g的搖蚊幼蟲產量[4].此外，搖蚊幼蟲的飼養(yǎng)，不僅可為生態(tài)毒理學研究提供試驗對象[5-7]，還可利用搖蚊幼蟲種類的敏感性和耐污染特性，反映水中的成分變化和污染程度，將其作為監(jiān)測水體污染的主要指示生物[8-9].搖蚊幼蟲營養(yǎng)豐富，蛋白質含量占干物重的41%～62%，脂肪占2%～8%.搖蚊幼蟲是重要的水生生物資源，對維持和促進漁業(yè)發(fā)展，關系重大[10].又因其區(qū)系組成與環(huán)境性能有密切關系，其群落組成和變化能反映環(huán)境的變動情況[11]，已被廣泛應用于水環(huán)境的監(jiān)測和評價.由于搖蚊幼蟲繁殖較慢，且不容易保活，在市場上價格昂貴.本實驗旨在對搖蚊幼蟲暫存條件優(yōu)化，延長搖蚊幼蟲的存活周期，降低搖蚊幼蟲作為餌料的成本，對漁業(yè)的發(fā)展具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 實驗地點與試驗材料

本實驗在常熟理工學院篤行樓水生生物實驗室進行，實驗所用搖蚊幼蟲均為從市場上采購所得.

1.2 試驗方法

1.2.1 搖蚊幼蟲的培養(yǎng)

將稱好的幼蟲轉移到盒內，盒子規(guī)格為長11 cm、寬7.5 cm、高6 cm，每個盒內按表1列出的試驗順序各加入對應的水量，貼好標簽，隨后按表2列出的試驗順序按標簽將對應的盒子分別放入5℃、10℃、15℃、25℃的保溫柜中養(yǎng)殖一個月.

在培養(yǎng)過程中，每天下午對各個保溫柜中盒內的搖蚊幼蟲進行換水，換進的水的水溫需與當前盒內水的溫度一致，并將死去的幼蟲挑去，以保持水的清潔，每天用溫度計觀察盒內水的溫度.一個月后將盒內水分用濾網濾干，用天平稱得各盒內搖蚊幼蟲的質量，求出各個盒內搖蚊幼蟲的存活率.

1.2.2 單因素試驗

分別考察溫度（5、10、15、25 ℃）、質量（10、20、30、50 g）、水量（50、100、150、200 ml）對搖蚊幼蟲存活率的影響.

1.2.3 正交試驗

根據單因素的試驗結果，設計正交試驗的因素水平，（見表1），優(yōu)化搖蚊幼蟲存活率的條件.

表1 正交試驗因素與水平

1.3 數據處理

參數計算依據及公式[12-13]為：

總偏差平方和（Total Bias Squares，SK）

因子偏差平方和（Factor Bias Squares，S）

均方和（Mean Squares，MS）

純偏差平方和（Pure Bias Squares）

貢獻率（Contribution Percentageρ因）

整個試驗先采用單因素試驗，隨后采用正交試驗，實驗結果進行統(tǒng)計分析，每組試驗都進行了1次重復.然后使用方差分析對可能影響搖蚊幼蟲存活率的三個因素即溫度、密度、水量進行顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對搖蚊幼蟲存活率的影響

在質量為30 g，水量為200 ml，保活溫度分別為5℃、10℃、15℃、25℃時，培養(yǎng)一個月，搖蚊幼蟲存活率見圖1.

由圖1可知，隨著溫度的升高，搖蚊幼蟲存活率大幅度下降.溫度越高，搖蚊幼蟲新陳代謝越快，耗氧量增大.因此，在5℃～25℃范圍內，保活溫度選擇在5℃較適宜.

2.1.2 質量對搖蚊幼蟲存活率的影響

在溫度為 5 ℃，水量為 200 ml，質量分別為 10、20、30、50 g時，培養(yǎng)一個月，搖蚊幼蟲存活率見圖2.由圖2可以看出，隨著質量的增加，搖蚊幼蟲的存活率沒有明顯變化，都維持在90%左右.結果說明搖蚊幼蟲能夠在高密度環(huán)境下存活.

2.1.3 水量對搖蚊幼蟲存活率的影響

圖1 溫度對搖蚊幼蟲存活率的影響

在溫度為5 ℃，質量為30 g，水量分別為50 ml、100 ml、150 ml、200 ml時，培養(yǎng)一個月，搖蚊幼蟲存活率見圖3.

由圖3可見，隨著水量的增加，搖蚊幼蟲存活率幾乎沒有變化.結果表明水量在50 ml～200 ml的變化對搖蚊幼蟲存活率沒有顯著影響.

圖2 質量對搖蚊幼蟲存活率的影響

圖3 水量對搖蚊幼蟲存活率的影響

2.2 正交試驗

為了確定在多因素條件下?lián)u蚊幼蟲存活的最佳條件，在單因素的基礎試驗的基礎上，選擇合適的參數范圍，對溫度（A）、質量（B）、水量（C），采用 L16(45)進行正交試驗，優(yōu)化最佳存活條件見表2.

從表2中直觀分析得：Y=74.56存活率最高，最佳試驗條件為AIB4C4.由于RA>RB>RC，因此因素重要性為A→B→C，最佳條件是AIB4C4．

假定試驗指標服從正態(tài)分布用總偏差平方和SK描述數據的總波動，用SA表示除隨機原因外（A因子偏差平方和）由于A因子的水平不同所引起的數據波動的變量.∵A至于第一列，∴SA=S1，B、C分別至于第二、三列，∴SB=S2，SC=S3.第四、五列為空白列（表上沒有列出），僅反映誤差造成的數據波動，稱為誤差的偏差平方和.

表2 L16(45)正交試驗設計及結果

若 F因 =V因 /Ve>F1- α（ f因，fe），則認為在顯著水平α上因子是顯著的.由于FA大于F3,6=4.757，因此因子A是顯著的，因子B，C不顯著，最佳條件的選擇A1，因子B、C水平可任意選取.

當試驗指標不服從正態(tài)分布時，進行方差分析的依據就不夠充分，此時可以用貢獻率來衡量因子作用的大小.由于S因中除了因子的效應外，還包括誤差，從而稱 S因-f因為因子的純偏差平方和，稱因子的純偏差平方和與總純偏差平方和的比為貢獻率.

從表3中知因子A最重要，由A引起的波動占98.16%，因子B、C的貢獻率不大，所以，B、C因子對搖蚊幼蟲存活率的影響不顯著.

2.3 水中溶解氧對搖蚊幼蟲體色的影響

圖4中，A、B、C、D四個盒內搖蚊幼蟲的質量分別為10 g、20 g、30 g、50 g，四個盒內水量一致，測出A、B、C、D四個盒內水的溶解氧分別為4.6，2.0，1.6，0.7 mg/L.從圖中可以很明顯地看出搖蚊幼蟲體色的鮮紅程度為：A>B>C>D.說明搖蚊幼蟲生活的水體中溶解氧越高，則搖蚊幼蟲體色的鮮紅程度越明顯.

表3 L16(45)正交試驗優(yōu)化條件方差分析

3 討論

3.1 溫度對搖蚊幼蟲存活率的影響

實驗結果表明，溫度是影響搖蚊幼蟲存活率的最關鍵因素，溫度越高，存活率越低.圖5是搖蚊幼蟲存活率與單因素溫度的關系曲線.從圖5中我們可以看到隨著溫度的升高，搖蚊幼蟲的存活率呈直線下降狀態(tài).溫度越高，新陳代謝越快，耗氧量增大，導致?lián)u蚊幼蟲生活環(huán)境惡化，如不及時換水就會影響其成活活率.圖5顯示當溫度降到5℃時，存活率最高，但0℃環(huán)境下?lián)u蚊幼蟲不能存活.在日常生活中，溫度是水產品活體運輸的重要影響因素之一，而降低環(huán)境溫度可減少水產品耗氧量、降低其新陳代謝、減少水質惡化、提高成活率、延長保活時間，確保產品在運輸、貯藏和銷售中的品質穩(wěn)定和食用安全.而影響保活的因素主要有溫度、氧氣及水質[14].早在1999年，劉淇等就對牙鲆進行了低溫保活實驗，并探討了其保活過程中的生理變化情況.張瑞霞[15]等通過測定3.5℃、6.5℃、9.5℃、20.0℃4種水溫下鯽魚的存活率、血液生化指標、排泄物氨態(tài)氮含量以及魚體肌肉質構、色度和理化指標的變化，觀察低溫處理對鯽魚生化特性及肉質的影響.結果表明，在6.5℃水溫下暫養(yǎng)5 d后存活率高達100%，同樣，低溫也適合搖蚊幼蟲的保活.

表4 因子與誤差的差率

圖4

3.2 水中溶解氧與搖蚊幼蟲體色的關系

實驗中發(fā)現(xiàn)處于水環(huán)境中的搖蚊幼蟲，高密度時搖蚊幼蟲的體色總體呈現(xiàn)暗黑色，低密度下時搖蚊幼蟲呈現(xiàn)血紅色.這是由于搖蚊幼蟲在高密度時耗氧極快，水中溶解氧不足；而在低密度時搖蚊幼蟲耗氧很慢，水中溶解氧較高.搖蚊幼蟲體內含有血紅蛋白，只有在有氧氣時，血紅蛋白才會與氧氣結合成亮紅色的氧合血紅蛋白[16]，從而使搖蚊幼蟲身體呈現(xiàn)紅色.所以，當將搖蚊幼蟲暴露在空氣中時，搖蚊幼蟲的體色會比在高密度下生活的搖蚊幼蟲的體色更加鮮紅.當搖蚊幼蟲質量增加時，若想保持搖蚊幼蟲體色為血紅色，則需要加入一定體積的水量保持水中溶解氧充足.

圖5 搖蚊幼蟲存活率與溫度的關系

3.3 提高搖蚊幼蟲存活率的有效方法

實驗結果表明，在50～200 ml范圍內，水量的變化對搖蚊幼蟲的存活率沒有顯著影響.每天堅持換水能有效提高搖蚊幼蟲的存活率.換水不僅能夠提供搖蚊幼蟲豐富的溶解氧，還能去除水體中搖蚊幼蟲的排泄物，凈化水質，從而改善搖蚊幼蟲生活環(huán)境.此外，當搖蚊幼蟲生活在有足夠水量的環(huán)境中時，只要經常保持換水，搖蚊幼蟲活力強盛；若搖蚊幼蟲在淺水區(qū)生活，不能完全浸沒在水體中時，搖蚊幼蟲自身便會分泌出大量的深黃色絮狀物來保護自己，活力減弱.劉偉東[17]等研究了大菱鲆在3℃±0.1℃條件下，有水和無水保活的成活率及生理變化情況.結果表明，有水保活72 h成活率達到100%，無水保活60 h成活率為95%.可見，對于生活在水環(huán)境中的搖蚊幼蟲經常換水、保持適當的密度和低溫是提高其存活率的有效方法.

[1]Armitage P D,Cranston P S,Pinder L C V.The Chironomidae Biology and ecology of norbiting midges[M].London:Chapman and Hall,1995:1-572.

[2]Sublette J E,Sublette MS.Family Chironomidae.In:Delfinado M&Hardy E D(eds.),Catalogue of the Diptera of the Oriental Re?gion[M].Honolulu:University Press of Hawaii,1973:389-422.

[3]王俊才，李開國.遼寧省搖蚊科幼蟲分類與檢索[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，1989：1-107．

[4]代田昭彥.搖蚊幼蟲的研究[M].北京：農業(yè)出版社，1986：1-186.

[5]Brooks B W，Turner P K，Stanley J K，et al.Wateborne and Sediment Toxicity of Fluxetine to Select Organisms[J].Chemsphere，2003，52（6）：135-142.

[6]Vermeulen A C，Liberboo G，Dumont P，et al.Exposure of Chironomus riparius（Diptera）to Lead，Mercury and β-Sitosterol：Ef?fects on Mouthpart Deformation and Moulting[J].Chemosphere，2000，41（4）：1581-1591.

[7]Martine E A，Moore B C，Schaumloffel J，et al.Morphological Abnormalities in Chironomus tentans Exposed to Cadmium-and Copper-Spiked Sediments[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2003，55（2）：204-212.

[8]王俊才，方志剛，鞠復華.搖蚊幼蟲分布及其與水質的關系[J].生態(tài)學雜志，2000，19（4）：27-37.

[9]徐希蓮.水生昆蟲與水質的生物監(jiān)測[J].萊陽農學院學報，2001，18（1）：66-70.

[10]王波.搖蚊幼蟲在水產上的應用[J]. 科學養(yǎng)魚，2002，11（7）：29.

[11]張平卿，王基琳.六盤山自然保護區(qū)的搖蚊科幼蟲及國內新記錄[J].寧夏大學學報：自然科學版，1987（1）：70-86.

[12]吳翊.應用數理統(tǒng)計[M].長沙：國防科技大學出版社，1997.

[13]袁執(zhí)法，周靜芋.試驗設計與分析[M].北京：高等教育出版社，2003.

[14]聶小寶，章艷，張長峰，等.水產品低溫保活運輸研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（12）：218-223.

[15]張瑞霞，張娟，熊善柏，等.低溫處理對鯽生化特性及肉質的影響[J].華中農業(yè)大學學報，2008，27（4）：532-534.

[16]汪青，項榮花，包永波，等.動物血紅蛋白研究進展[J].寧波大學學報：理工版，2011，24（2）：20-24．

[17]劉偉東，薛長湖，殷邦忠，等.低溫下大菱鲆有水和無水保活過程中生理生化變化的研究[J].漁業(yè)科學進展，2009，30（5）：69-74.