響應(yīng)曲面法優(yōu)化山茱萸多糖提取

戴陽軍，曾雅雯，單 康

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

山茱萸又名蜀棗、鼠矢、雞足、實棗兒、棗皮等.在我國分布較廣，除了分布在長江以北，秦嶺等廣大中低山丘陵地區(qū)，浙江的杭州、河南南陽、陜西漢中等地區(qū)也是山茱萸的主產(chǎn)區(qū)[1].山茱萸呈生理堿性，具有降血糖、補益肝腎、固精縮尿等多種功能，山茱萸在國內(nèi)運用較多.早在古代，人們就將山茱萸運用到一些病理的治療中.傳統(tǒng)中藥中常將其與枸杞子、杜仲、熟地等多種藥材結(jié)合，專治肝腎不足、耳鳴腰酸、頭暈?zāi)垦５?山茱萸多糖具有抗氧化和清除自由基等方面的作用.

對于山茱萸的研究，國內(nèi)較多.易曉衛(wèi)等[2]曾就山茱萸的營養(yǎng)價值及市場價值做出報導(dǎo)；聞雅嵐等[3]研究了山茱萸發(fā)酵酒的生產(chǎn)工藝；徐懷德等[4]研究了澄清的山茱萸保健飲料工藝；胡園園、李豪等[5-6]對山茱萸提取多糖的工藝展開了多項研究.本試驗在前人研究提取山茱萸多糖的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗設(shè)計得到微波萃取山茱萸多糖的最佳方案.

1 材料

1.1 原料與試劑

原料：山茱萸（陜西佛坪袁大頭土特產(chǎn)食品公司）、白砂糖、酵母（常熟市常客隆超市）等.試劑：乙醇、苯酚、硫酸（均為分析純級）等.

1.2 儀器設(shè)備

LY-3L微波輔助萃取儀器：上海隆譽微波設(shè)備有限公司；DZ-400/2ES真空包裝機：華聯(lián)機械集團有限公司；HHT4-YX-280D不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋：北京中西遠大科技有限公司；LP502B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；BCD-196KF冰箱：青島海爾股份有限公司；722紫外-可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LD4-ZA離心機：北京醫(yī)用離心機廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；WGL-230 B電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京遠拓科學(xué)儀器有限公司等.

2 方法

2.1 工藝流程圖

原料選擇→清洗、瀝干→發(fā)酵→干燥→粉碎→加水→微波輔助萃取→過濾→配料→濃縮.

2.2 操作要點

2.2.1 發(fā)酵

利用酵母在生產(chǎn)過程中消耗單糖及雙糖等寡糖來提高山茱萸多糖純度，此外，發(fā)酵過程消耗有機酸，有益于山茱萸去酸去澀.發(fā)酵溫度為38℃，酵母添加量為1%，發(fā)酵時長為90 min.

2.2.2 干燥

鮮果易受到季節(jié)性影響，干燥之后使得山茱萸便于長期加工生產(chǎn).采用恒溫烘箱對山茱萸進行烘干，烘干溫度為65℃，烘干時長根據(jù)烘干數(shù)量決定.烘干標(biāo)準(zhǔn)以山茱萸硬度合適，顏色暗紅為準(zhǔn).

2.2.3 微波輔助萃取

微波輔助萃取與實驗所得多糖提取率有較大聯(lián)系，因此微波輔助萃取過程需進行相關(guān)工藝優(yōu)化.

2.3 山茱萸多糖萃取工藝優(yōu)化

對料液比、微波時長及微波功率這三項因素進行單因素試驗.根據(jù)單因素對山茱萸多糖萃取效果的影響，對應(yīng)項山茱萸多糖萃取率的主要因素進行中心組合試驗，以山茱萸多糖提取率為響應(yīng)值，進行優(yōu)化分析.

2.3.1 單因素實驗

①料液比對山茱萸多糖提取率的影響

分別稱取經(jīng)過預(yù)處理的山茱萸粉末5份，每份稱取質(zhì)量為10.0 g，置于三角錐形瓶中.在其他因素不變的條件下，分別按照0.03、0.05、0.07、0.09、0.11的料液比向錐形瓶中添加蒸餾水.80℃水浴30 min，固定微波功率600 W，微波時長為10 min.將萃取所得溶液進行離心分離，取上清液稀釋定容，測定溶液的吸光值.并以此為依據(jù)，判定料液比對山茱萸多糖提取率的影響.

②微波功率對山茱萸多糖提取率的影響

分別稱取經(jīng)過預(yù)處理的山茱萸粉末5份，每份稱取量為10.0 g，置于三角錐形瓶中.向錐形瓶中添加250 mL蒸餾水，在80℃條件下水浴30 min.設(shè)置固定微波時長為10 min，在其他因素不變的條件下，微波功率分別設(shè)定為400，500，600，700，800 W.將萃取所得溶液進行離心分離，取上清液稀釋定容，測定溶液的吸光值.并以此為依據(jù)，判定微波功率對山茱萸多糖提取率的影響.

③微波時長對山茱萸多糖提取率的影響

分別稱取經(jīng)過預(yù)處理的山茱萸粉末5份，每份稱取量為10.0 g，置于三角錐形瓶中.向錐形瓶中添加250 mL蒸餾水，在80℃條件下水浴30 min.設(shè)置固定微波功率為600 W，在其他因素不變的條件下，微波時長分別設(shè)定為6，8，10，12，14 min.將萃取所得溶液進行離心分離，取上清液稀釋定容，測定溶液的吸光值.并以此為依據(jù)，判定微波時長對山茱萸多糖提取率的影響.

2.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

為了確定微波輔助萃取山茱萸多糖的最佳工藝，選出了微波輔助萃取山茱萸多糖影響主要的三因素：料液比、微波功率以及微波時間進行進一步分析.以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，對影響山茱萸多糖提取率的三個因素進行響應(yīng)面試驗.

2.4 山茱萸多糖測定與感官檢驗

2.4.1 多糖含量的測定

山茱萸多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[7-9].現(xiàn)以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，葡萄糖溶度為橫坐標(biāo)，所測得吸光值為縱坐標(biāo).圖1為葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線直線圖，得到的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=12.532x+0.0155，其中R2=0.9931.按照下面方法，計算多糖提取率：

多糖提取率=（多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）×體積（mL）/原料質(zhì)量（mg））×100%.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3 結(jié)果分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 料液比對微波輔助萃取多糖提取率的影響

由圖2可看出，當(dāng)提取料液比在0.03～0.05時，山茱萸多糖的提取率隨著料液比的升高而增加，當(dāng)料液比達到0.05時，達到最大提取率，當(dāng)料液比超過0.05時，提取率開始下降.因此選擇料液比為 0.04～0.06這一區(qū)間.

3.1.2 微波功率對山茱萸多糖提取率影響

由圖3中可看出，隨著功率的不斷增加，提取率呈峰值變化.當(dāng)功率在400～500 W這一區(qū)間時，提取率呈上升趨勢；超過500 W，提取率呈下降趨勢.當(dāng)微波功率在500 W時，吸光值達到較高值.比較分析，選擇微波功率在500～600 W這一區(qū)間.

3.1.3 微波時間對山茱萸多糖提取率影響

由圖4可看出，當(dāng)微波時間在6～8 min時，提取率不斷上升，且上升趨勢較大；當(dāng)微波時間在8～10 min時，提取率上升趨勢平緩；當(dāng)微波時間在10 min以上時，提取率持續(xù)下降.比較分析，選擇微波時間在8～10 min這一區(qū)間.

圖2 料液比對山茱萸多糖提取率的影響

3.2 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計結(jié)果分析

3.2.1 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

以單因素實驗為基礎(chǔ)，對山茱萸的影響因素進行BBD試驗，以山茱萸多糖提取率為響應(yīng)值.響應(yīng)面因素水平表所示，響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果見表1、表2.

分析得到二次多項回歸方程為：

Y=+ 12.31-0.82A-0.65B-0.42C + 0.80AB +1.10BC-1.70A2-2.90B2-2.83C2.

繼續(xù)對所得到的結(jié)果進行分析，分析結(jié)果如表3所示.

經(jīng)顯著性檢驗可以看出，回歸模型高度顯著，相關(guān)系數(shù)R2為0.9801，說明模型的擬合度好，表明實驗值和預(yù)測值時間有很好的一致性；調(diào)整相關(guān)系數(shù)adj-R2為0.9082說明山茱萸多糖得率模型能夠解釋各因素對提取率的影響.本試驗中模型失擬項的P＜0.0001，模型失擬項不顯著，進一步說明此模型的擬合度良好.變異系數(shù)（C.V%）遠小于5%表示試驗的精確度高，說明模型方程能夠較好地反應(yīng)真實值.綜上所述，回歸模型擬合程度良好，實驗誤差小，能夠準(zhǔn)確分析和預(yù)測山茱萸多糖的提取率.

各單因素的P值均遠小于0.05，說明各單因素對結(jié)果的影響均是顯著的；交互項中，AB和BC對于結(jié)果的影響是顯著的，AC對于結(jié)果的影響不顯著；二次項對于結(jié)果的影響均為極顯著.

對結(jié)果影響顯著的交互項響應(yīng)曲面圖如圖5所示：

表1 響應(yīng)面因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

3.2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗

對所得結(jié)果進一步進行優(yōu)化，選取多糖提取率為MAX，設(shè)置區(qū)間為7%～15%，最終得到最佳工藝條件為：料液比為0.05（1：19），微波功率為541.17 W，微波時長為8.87 min.該條件下，多糖提取率理論值為12.51%.按照此條件進行多組優(yōu)化試驗，設(shè)置料液比為0.05（1：19），微波功率為541 W，微波時長為8.87 min，提取率為12.34%±0.50，與理論值的誤差在5%范圍內(nèi)，說明由此優(yōu)化的數(shù)據(jù)真實可靠，具有實際應(yīng)用價值.

4 結(jié)論

通過Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗設(shè)計得到了微波萃取多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比為0.05（1：19）、微波功率為541 W、微波時間為8.87 min.在此條件下，多糖得率為12.34%±0.50.通過驗證實驗所得實際值與模型預(yù)測值接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸多糖微波提取工藝是準(zhǔn)確可行的，并為山茱萸的進一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù).

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