脂聯素基因+45多態性與肥胖兒童及青少年非酒精性脂肪性肝病的關系

1.暨南大學第二臨床醫學院（深圳市人民醫院）感染內科 （廣東 深圳 518020）

2.南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院兒科 （廣東 深圳 518028）

彭 紅1董國慶2鐘麗華2

·腹部疾病·

脂聯素基因+45多態性與肥胖兒童及青少年非酒精性脂肪性肝病的關系

1.暨南大學第二臨床醫學院（深圳市人民醫院）感染內科 （廣東 深圳 518020）

2.南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院兒科 （廣東 深圳 518028）

彭 紅1董國慶2鐘麗華2

目的 觀察脂聯素(ADP)基因+45多態性在肥胖兒童及青少年非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的分布，探討其基因多態性與血清ADP、胰島素抵抗(IR)、體脂、血脂的關系。方法 選取100例單純性肥胖NAFLD兒童及青少年，年齡6.5-18.3歲，另選70例年齡、性別相匹配的健康兒童及青少年。清晨空腹測量其體質量、身高、腰圍(WC)和臀圍，計算體塊指數(BMI)和腰臀比(WHR)、腰圍身高比(WHtR)，靜脈采血檢測血清胰島素(FINS)、糖(FBG)、膽固醇 (TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、ALT、AST等，計算穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)，行肝膽等部位超聲檢查。采用ELISA法測定ADP濃度，酚氯仿法提取DNA，經PCR擴增后用雙脫氧鏈終止法進行基因測序。結果 NAFLD組血ADP為(2.79±2.19)mg/L，明顯低于健康對照組的(3.90±2.13)mg/L，與BMI、WHtR、TG、FINS、HOMA-IR值呈負相關，其中HOMA-IR為影響ADP最為顯著的因素；NAFLD組ADP基因+45位點T/G的基因型分布和等位基因頻率與對照組的差異無顯著性意義(P＞0.05)，血ADP、血脂、血糖、胰島素和IR、BMI、WC、WHR、WHtR等在NAFLD組ADP基因+45位點各基因型間的差異也無統計學意義(P均＞0.05)。結論 脂聯素基因+45T/G多態性可能與深圳市漢族單純性肥胖兒童及青少年NAFLD及其代謝指標無顯著關聯性。

脂聯素基因；多態性；非酒精性脂肪性肝病；肥胖；兒童及青少年

表1 兩組脂聯素SNP+45基因型及等位基因頻率比較

表2 NAFLD組脂聯素+45各基因型間血脂聯素及代謝指標比較(±S)

表2 NAFLD組脂聯素+45各基因型間血脂聯素及代謝指標比較(±S)

注:a為自然對數值

TT型(n=46) TG型(n=50) GG型(n=4) F PADPa(ug·ml-1) 2.52±2.13 3.15±2.01 4.35±2.94 1.823 0.402BMI(kg·m-2) 26.78±3.67 25.12±4.11 24.19±2.93 1.312 0.275WC(cm) 92.56±13.67 89.11±13.97 87.11±19.11 0.389 0.680WHR 0.94±0.06 0.94±0.04 1.00±0.09 1.228 0.302WHtR 0.60±0.06 0.59±0.05 0.60±0.01 0.202 0.815FBG(mmol·L-1) 5.06±0.59 4.90±0.45 5.10±0.06 0.655 0.522FINSa(pmol·L-1) 4.78±0.69 4.50±0.76 4.33±0.36 1.080 0.349HOMA-IRa3.41±0.75 3.08±0.82 2.93±0.37 1.178 0.316TC(mmol·L-1) 4.13±1.38 4.35±0.80 4.58±0.74 0.315 0.731TG(mmol·L-1) 2.00±1.50 1.95±1.67 3.51±0.14 0.893 0.416HDL-C(mmol·L-1) 0.94±0.26 1.01±0.31 1.06±0.20 1.586 0.216LDL-C(mmol·L-1) 3.07±1.69 2.84±0.89 2.96±0.74 0.190 0.828

兒童和青少年非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝細胞脂肪變性和脂肪蓄積為病理特征的臨床綜合征，是代謝綜合征在肝臟的表現[1]，與肥胖、胰島素抵抗(IR)密切相關。隨著兒童和青少年肥胖發病率的增高，該年齡階段的代謝綜合征發病率也逐漸增高。研究顯示脂聯素(adiponectin，ADP)基因多態性與代謝綜合征密切相關[2]。本文通過觀察單純性肥胖兒童及青少年NAFLD的血清ADP及其+45基因變化，以探討ADP基因+45多態性與NAFLD及IR、體脂、血脂的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月～2014年10月在深圳市人民醫院感染內科和深圳市婦幼保健院兒科就診及住院的單純性肥胖兒童及青少年非酒精性脂肪性肝病100例(NAFLD組)，均為漢族，其中男58例，女42例；年齡6.5～18.3歲，平均(12.02±4.10)歲，身高在同年齡同性別組正常范圍內，無飲酒史。由專人行體格檢查和腹部彩超檢查，同時行肝、腎功能、內分泌等輔助檢查，除外其他中樞神經系統疾病、遺傳代謝病及內分泌病引起的繼發性肥胖，排除甲、乙、丙型肝炎、肝外感染、藥物性及免疫性肝病。肥胖診斷標準為與成年人界值點接軌的中國2～18歲兒童超重、肥胖篩查BMI界值點法[3]，NAFLD依據2010年中華醫學會肝病學分會《非酒精性脂肪肝病診療指南》診斷[4]。隨機選擇同期健康體檢者70例為對照組，均為漢族，其中男40例，女30例，年齡5.5～18歲，平均(11.12±5.90)歲，體重、身高在正常范圍內，無感染及慢性疾病。兩組年齡、性別等比較，差異無統計學意義，P＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 體格指標測量：受試者于清晨8～9時空腹測量其體質量、身高、腰圍(WC)和臀圍，計算體塊指數[BMI=體重(Kg)/身高2(m2)]和腰臀比[WHR=腰圍(cm)/臀圍(cm)]、腰圍身高比[WHtR=腰圍(cm)/身高(cm)]。

1.2.2 血清標本采集及實驗室檢測：受試者均隔夜禁食后于清晨8～9時空腹抽取靜脈血5ml，分離血清后立即檢測胰島素(FINS)、糖(FBG)、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和ALT、AST及甲、乙、丙型肝炎病原學標志物等；余血清置于-70℃冰箱保存，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測ADP，試劑盒由美國R&D公司提供，儀器為西門子醫學診斷產品有限公司生產的BEPⅢ全自動酶免分析儀。所有檢測均按說明書由專人操作。以穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)公式計算IR值。

圖1 ADP基因+45位點T/G測序圖

1.2.3 脂聯素基因+45多態性檢測

1.2.3.1 DNA提取和擴增：取靜脈血2ml，EDTANa2抗凝，酚氯仿法提取DNA。按照文獻[5]方法由上海生工生物工程公司合成引物，用于擴增目的基因。正向引物：5'-TCTCTCCATGGCTGACAGTG-3'，反向引物：5'-AGATGCAGCAAAGCCAAAGT-3'。聚合酶鏈反應體系：反應總體積25μL，成分為：2mmol/L dNTP 2.5μL、5umol/LTaqDNA聚合酶2.5μL、樣本DNA 1μL、Buffer2.5μL、MgCl22.5μL、正反向引物各1μL，無菌用水12μL。PCR反應條件為96℃預變性5min→96℃40s→62℃40s→72℃40s，循環35次，72℃延伸10min。

1.2.3.2 ADP基因+45位點T/G測序(見圖1)：取PCR產物20μL由生工生物工程(上海)股份有限公司應用雙脫氧鏈終止法進行測序，試劑為Big Dye terminator v3.1，測序儀為美國Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。檢驗數據是否呈正態分布，血清脂聯素、胰島素、HOME-IR為非正態分布，轉換為自然對數后按照正態分布比較。計數資料用R×C卡方檢驗；計量資料采用X-±S表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析；相關性分析用Pearson相關分析和多元逐步回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NAFLD患者血脂聯素變化及與代謝指標相關性分析 NAFLD組血ADP水平為(2.79±2.19)mg/ L，低于健康對照組的(3.90±2.13)mg/L，差異有顯著統計學意義，t=-2.086，P=0.041。ADP與BMI、WHtR、TG、FINS、IR值呈負相關，r分別=-0.195、-0.191、-0.232、-0.308、-0.312，P分別=0.037、0.039、0.023、0.002、0.002；與WC、WHR、GLU、TC、HDL-C、LDL-C均無相關性，P均＞0.05；采用多元逐步回歸分析，IR為影響ADP最為顯著的因素，R2=0.085。

2.2 NAFLD組與正常對照組脂聯素+45位點基因型及等位基因頻率比較(見表1) 對兩組ADP+45基因型分布進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，P均＞0.05，所選人群具有群體代表性。兩組基因型及等位基因頻率的差異均無統計學意義，P均＞0.05。

2.3 NAFLD組脂聯素+45各基因型間血脂聯素及代謝指標比較(見表2) 血ADP、血脂、血糖、胰島素和IR、BMI、WC、WHR、WHtR等在NAFLD組ADP基因+45位點各基因型間的差異均無統計學意義，P均＞0.05。

3 討 論

脂聯素是由脂肪細胞分泌的一種激素蛋白，與Ⅶ型、Ⅹ型膠原和補體C1q有高度同源性，其基因全長17kb，定位于染色體3q27，由2個內含子和3個外顯子組成，全基因組掃描顯示該區域存在肥胖及其相關疾病(NAFLD、2型糖尿病和代謝綜合征等)的易感位點[6]。脂聯素基因的單核苷酸多態性與低脂聯素血癥密切相關，而低脂聯素血癥可能會增加2型糖尿病、胰島素抵抗及代謝綜合征等的發生機會[7,8]。本組NAFLD兒童及青少年存在低脂聯素血癥，與胰島素抵抗、BMI、WHtR、TG、FINS等呈負相關。

一般認為，NAFLD存在胰島素抵抗和血脂紊亂，主要是游離脂肪酸和TG增加。本文顯示單純性肥胖兒童及青少年NAFLD以腹型肥胖為主，存在明顯的胰島素抵抗，血TG和LDL-C明顯升高。脂聯素作為胰島素增敏激素，能抑制肝糖異生而增加骨骼肌脂肪酸氧化，使TG水平降低，改善IR。另外，脂聯素可促進肝內脂肪酸氧化，減少肝臟糖異生的原料；還增強胰島素對肝細胞內糖異生和肝糖輸出的抑制作用[8]。顯示脂聯素與NAFLD的發生密切相關。

研究發現ADP基因存在十余個常見的單核苷酸位點(SNPs)以及一些罕見的錯義突變。韓國、日本、加拿大、西班牙、伊朗、芬蘭、希臘等國報道ADP+45多態性與肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合癥、2型糖尿病等的相關性存在明顯的種族差異，而臺灣、法國、瑞士、捷克、馬來西亞等國的研究未發現這種相關性[7]。在我國ADP基因+45多態性與肥胖及相關疾病的相關性報道也不盡相同，可能與我國多民族有關。李黎等對我國22個研究的分析顯示ADP基因+45多態性與中國人群2型糖尿病相關，G等位基因是2型糖尿病的危險因素[7]。吳靜等認為脂聯素基因SNP+45變異與兒童單純性肥胖相關，可誘發產生胰島素抵抗，高脂血癥，且影響肥胖兒童血漿脂聯素水平的表達[9]。而有些研究未發現ADP基因+45多態性與代謝因素或疾病相關，如血脂[10]、肥胖以及肥胖類型和血清脂聯素水平[11]、成人NAFLD的發病易感性[12]。本組對肥胖NAFLD兒童及青少年研究的結果顯示，ADP基因+45位點T/G的基因型分布和等位基因頻率與正常人群無差異，血ADP、血脂、血糖、胰島素水平和IR、BMI、WC、WHR、WHtR等在ADP基因+45位點各基因型間也無差異，表明脂聯素基因+45T/G多態性與深圳市漢族單純性肥胖兒童及青少年NAFLD及其代謝指標無顯著關聯性。

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Association between Adiponectin Gene SNP+45 and Non-alcoholic Fatty Liver Disease in Obese Children and Adolescents

PENG Hong1, DONG Guo-qing2, ZHONG Li-hua2. 1 Department of Infectious Disease,Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020； 2 Department of Pediatrics, Shenzhen Maternal and Child healthcare Hospital affiliated to the Southern Medical University, Shenzhen 518028,Guangdong province, China

Objective To study the relationship between adiponectin gene +45 polymorphism and serum adiponectin(ADP), insulin resistance(IR), body fat and serum lipids in the obese children and adolescents with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).Methods One hundred simple obese children and adolescents with NAFLD aged 6.5 years to18.3 years and 70 healthy children and adolescents of similar age and sex (healthy control group) were randomly enrolled in the study. Early in the morning, fasting body weights, heighs, waist circumferences and hip circumferences were measured for calculation of BMI ,WHR and WHtR, and venous blood samples were collected for test of serum insulin(FINS), glucose(FBG), total cholesterol(TC), triglycerides(TG), high density lipoprotein cholesterol(HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase (AST), which contributed to the calculation of homeostasis model assessment-Insulin resistance (IR=FINS×FBG/22.5). Ultrasonographic examinations were given to the liver and related organs. Serum ADP levels were measured by ELISA, and DNA sequencing after PCR amplification were performed with dideoxy chain termination method. Results Serun ADP level in NAFLD group was 2.79±2.19 mg/L, significantly lower than the healthy control (3.90±2.13 mg/L), it was negatively correlated with BMI, WHtR, TG, FINS and IR values, and IR was the most significant factor that affected serum ADP level. NO significant differences in genotype or allele frequency of ADP gene SNP+45 between NAFLD group and healthy controls(P＞0.05). There was no difference of serum ADP, lipid, FBG, FINS and IR, BMI, WC, WHR, WHtR among different genotype of +45 site in children and adolescents with NAFLD(all P ＞0.05). Conclusions ADP gene SNP+45 may be not associated with occurrence of NAFLD and the metabolic parameters in Chinese simple obesity children and adolescents of Shenzhen.

Adiponectin Gene； Polymorphisms； Nonalcoholic Fatty Liver Disease； Obesity； Children； Adolescents

R322.4+7

A

2015-06-10

彭 紅，女，感染內科專業，副主任醫師，主要研究方向：慢性肝病

董國慶

DOI∶10.3969/j.issn.1009-3257.2015.03.015