IFITM5在不同癌細胞系中的差異表達*

1.濟南大學、山東省醫學科學院醫學與生命科學學院 （山東 濟南 250022）

2.山東省醫藥生物技術研究中心，山東省醫學科學院 （山東 濟南 250062）

3.山東省立醫院 （山東 濟南 250021）

4.天津市武清區人民醫院骨三科 （天津 301700）

韓 峰1,2魯艷芹2王延宙3任秀智4石賢龍1,2韓金祥2

·系統性疾病·

IFITM5在不同癌細胞系中的差異表達*

1.濟南大學、山東省醫學科學院醫學與生命科學學院 （山東 濟南 250022）

2.山東省醫藥生物技術研究中心，山東省醫學科學院 （山東 濟南 250062）

3.山東省立醫院 （山東 濟南 250021）

4.天津市武清區人民醫院骨三科 （天津 301700）

韓 峰1,2魯艷芹2王延宙3任秀智4石賢龍1,2韓金祥2

目的 研究干擾素誘導的跨膜蛋白5(IFITM5)在人骨肉瘤15種細胞系中的表達。方法 應用RT-QPCR和Western blot檢測IFITM5在SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD等癌細胞系中mRNA和蛋白表達差異。結果 在H7402、RD、HEP2細胞系中IFITM5 mRNA和蛋白的表達水平最低，其他細胞系次之，在SAOS2和3A0細胞系中兩者均呈高表達。結論 IFITM5在癌細胞系中存在并有表達差異，為后續研究IFITM5在腫瘤中的作用奠定基礎。

IFITM5；mRNA；蛋白；癌細胞系

干擾素誘導跨膜蛋白基因家族(IFITM)于1984年篩選cDNA文庫時首次發現[1]，其在進化上高度保守性。目前已在多個物種中被發現,其中研究較多的則是人源和鼠源家族。人類包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10等5個家族成員，這些家族成員均包含一個保守的CD225域和兩個終端變異域。其編碼的蛋白質在生殖細胞成熟、細胞-細胞粘附、白血病、腫瘤抑制、抗病毒活性、骨形成、胚胎發育發揮重要作用。IFITM參與了腫瘤抑制通路，對癌細胞具有抗增殖的作用。IFITM肽參與了腫瘤抗原樹突的運輸，其蛋白具有腫瘤抑制的性質，甚至可以在腫瘤形成之前起調制作用[2-5]。盡管采用手術、化療、放療等治療手段使癌癥的存活率有了很大的提高，但晚期患者即使經過系統治療達到完全緩解，仍有60%～70%會出現復發[6]，而IFITM家族腫瘤抑制作用的發現可能會對降低癌癥的復發率提供一種可能。

IFITM5是干擾素誘導跨膜蛋白基因家族成員之一，該基因位于人類第11號染色體11p15.5上，開放閱讀框共399bp，含有兩個外顯子和一個內含子，其編碼的蛋白質分子量為14.8KDa，由132個氨基酸組成。該蛋白結構包括胞外區N端和C端以及胞質區的loop，其C端為富含天冬氨酸區域，可參與Ca2+的結合[7-8]。IFITM5是一種成骨細胞標記基因，為骨礦化因子[9]，在骨組織和成骨細胞高表達，在成纖維細胞譜系也有低水平的表達,其主要在成骨細胞中存在，在巨噬細胞和脾臟中也有少量存在[10]，而IFITM5在癌癥方面的相關研究鮮有報道。

本實驗從基因水平和蛋白水平初步分析了IFITM5在不同癌細胞系中的差異表達，為進一步探究IFITM5在癌細胞系中的作用機制奠定了基礎。

1 材料

1640培養基、McCoy's 5A培養基、胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司，乙醇、甲醇、異丙醇、氯仿購自國藥集團，TRIzol Reagent 購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自寶生物公司，SYBR Green購自Roche公司，胰酶細胞消化液、青霉素—鏈霉素雙抗、細胞裂解液、磷酸鹽緩沖液、轉膜液、PMSF、BCA試劑盒、過硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、TEMED、Arc-Bis(29：1)、Tris-HCl(pH 8.8，pH 6.8)，5XSDS樣品緩沖液、HRP標記山羊抗兔IgG、GAPDH多克隆抗體、一抗稀釋液、蛋白顯影定影試劑盒購自碧云天公司，PVDF膜購自Millipore公司，兔抗IFITM5多克隆抗體購自Sigma公司，彩色預染蛋白marker、ECL發色液購自Thermo公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD細胞復蘇后用含有10%FBS、100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的1640培養基培養(SAOS2細胞用McCoy's 5A培養基培養)，條件為37℃、5%CO2，隔兩天換液一次。

2.2 RT-QPCR測定轉錄因子mRNA表達水平RNA提取與分析：收取SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD細胞，采用TRizol法提取RNA，用DEPC水溶解沉淀獲得細胞總RNA，紫外分光光度計檢測A260/A280的比值，測定RNA純度和濃度。

RT反應體系：采用Random Primers為RT反應引物；總反應體系為20ul，包括1ug的總RNA，5×PrimeScript Buffer 4ul，RNase Inhibitor(40 U/ul)0.5ul，PrimeScript Reverse Transcriptase(200 U/ul)1ul，RNase free dH2O調總體積至20ul。30℃ 10min，42℃ 60min，70℃，15min。

圖1 不同癌細胞系IFITM5/GAPDH的基因相對差異表達。圖2 不同癌細胞系IFITM5和GAPDH的蛋白表達。圖3 不同癌細胞系IFITM5/GAPDH的灰度相對比值。

Real-time PCR反應：總反應體積為10ul，包括2ul cDNA，2×SYBR I Master 5ul，HGAPDH-F/ HGAPDH-R各1ul或IFITM5-F/IFITM5-R各1ul，RNase free dH2O補足至10ul。循環參數：95℃預變性，95℃10S，60℃ 10s共45個循環，最后72℃延伸10S。

2.3 Western blot 檢測IFITM5的表達 收集SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD細胞，用預冷的PBS洗滌三次，提取細胞總蛋白，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，超聲破碎后12000rpm離心5min，吸取上清，測定樣品蛋白濃度后加入5Xloading buffer 100℃煮沸5min使蛋白變性。不同濃度的蛋白樣品取等量蛋白樣品20ug進行SDS-PAGE電泳，300mA濕轉1.5h，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，TBST洗三遍，一抗4℃過夜，TBST洗三遍，二抗室溫孵育1h，TBST洗三遍后化學發光顯色，利用富士LAS4000mini化學發光成像儀自動曝光成像顯影。

3 實驗結果

3.1 不同癌細胞系中IFITM5 mRNA表達差異 RTQPCR結果顯示：不同癌細胞系中IFITM5的基因相對表達具有顯著性差異，SAOS2、3A0癌細胞系中IFITM5的基因相對表達明顯高于SKOV3、HEPG2等癌細胞系，其中H7402、HEP2、RD癌細胞系IFITM5的基因相對表達量最低(圖1)。

3.2 不同癌細胞系中IFITM5蛋白表達差異Western blot結果顯示：不同癌細胞系的蛋白提取液在相對分子質量14.8KD處可檢測到一條蛋白質條帶，其IFITM5蛋白表達水平不一，其中在人成骨肉瘤(SAOS2)細胞系中表達量最高，其次是人卵巢癌(3AO)細胞系，人肝癌(H7402)細胞系表達量最低(圖2)。圖3中目的蛋白IFITM5與內參GAPDH灰度值的比值分析從0到0.45相差較大，具有顯著性差異。

4 討論

干擾素誘導跨膜蛋白是干擾素介導的先天免疫系統的重要組成部分，它們在腫瘤抑制中起著一定的作用，這可能與它們控制細胞周期的能力有關。細胞從正常狀態到癌變過程中IFITM會經常出現異常表達[2]。同一個人正常組織、癌周組織和癌組織之間基因的表達存在差異顯著性。不同的癌組織樣本IFITM的表達高低不一，IFITM水平的上調或下調可能依賴于癌組織類型，也可能一起作用于癌細胞的突變[11-12]。IFITM在不同的腫瘤中可能具有不同的作用，腫瘤發生涉及細胞周期控制的失活和DNA損失修復能力的減弱。DNA損傷修復能力的缺失導致的DNA倒置、染色體重組等可能有IFITM基因的參與[13]。IFITM基因表達水平缺失后腫瘤的癥狀就會明顯，所以該基因被認為具有腫瘤抑制作用。然而，多數癌細胞解除了對IFITM基因轉錄的控制，表明在癌癥發展階段至少有一種干擾素誘導跨膜蛋白基因在抗增殖通路中是保持沉默的[2]，而IFITM5也是干擾素誘導跨膜蛋白基因家族成員之一，其在人類免疫及癌癥形成方面的相關研究較少，尚有待于進一步探索。

本實驗通過實時熒光定量PCR和Western blot對 15種癌細胞系進行基因和蛋白相對差異分析，發現IFITM5在骨腫瘤以及人卵巢癌細胞系中高表達。在肝癌H7402與橫紋肌肉瘤RD等細胞中表達量低。本研究結果顯示IFITM5在多種癌細胞系中存在并有表達差異，它是否可以作為骨腫瘤以及其它腫瘤的生物標記物及其與腫瘤的關系等尚有待于進一步研究。

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Different Expression of IFITM5 in Cancer Cell Lines*

HAN Feng1,2, LU Yan-qin2, WANG Yan-zhou3, et al., 1 School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong; Academy of Medical Sciences, Jinan 250022,China; 2 Shandong Medicinal Biotechnology Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, Shandong, China,et al.

Objective To investigate the expression level of IFN-inducible transmembrane protein 5(IFITM5) in 15 different cancer cell lines.Methods RT-QPCR and Western blot were performed to detect the expression level of IFITM5 in SAOS2,3A0, SKOV3, HEPG2, HEP2, ACCM, HT29, MDA-MB-231, H7402, HELA, HEK-293, HL-60, K562, THP1 and RD cancer cell lines.Results There was remarkable difference in the expression of IFITM5 in this cancer cell lines.The lowest expression level of mRNA and protein were detected in H7402,RD and HEP2 cell lines .The highest IFITM5 expression was observed in SAOS2 cells,followed by 3AO.Conclusions Significant differential expression of IFITM5 in 15 cancer cells was observed, which laid the foundation for further research on the relationship of IFITM5 and tumor.

IFITM5; MRNA; Protein; Cancer Cell Lines

R73-3

A

國家科技支撐計劃，課題編號：2013BAI07B01

2015-03-26

韓 峰，男，藥學專業，研究生，主要研究方向：IFITM5基因-14C＞T定點突變在骨痂形成中的作用

韓金祥

DOI∶10.3969/j.issn.1009-3257.2015.02.014