葉片山海綿共附生細菌的防污活性研究

陳志穎,王 祥,蘇 培,馮丹青,柯才煥

(廈門大學海洋與地球學院,福建廈門361102)

葉片山海綿共附生細菌的防污活性研究

陳志穎,王 祥,蘇 培,馮丹青*,柯才煥

(廈門大學海洋與地球學院,福建廈門361102)

從葉片山海綿(Mycale phyllophila)中分離純化得到7株共附生細菌,經16S r DNA序列比對,分別歸屬于芽抱桿菌屬(Bacillus,5株)、假弧菌屬(Pseudovibrio,1株)和短桿菌屬(Brevibacterium,1株).菌株經發酵培養后對發酵液進行提取,以翡翠貽貝(Perna viridis)足絲分泌抑制實驗檢測提取物的防污活性.檢測結果表明,菌株NAP1和NAP7的提取物顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,其半抑制濃度(EC50)分別為55.26和14.85μg/m L,其余5株菌株的提取物均無防污活性.結合形態觀察、生理生化特征和16S r DNA序列比對,將菌株NAP7初步鑒定為脫氮假弧菌(Pseudovibrio denitrificans).另外,進一步對菌株NAP7提取物進行活性部位追蹤,以不同極性的溶劑進行萃取,依次獲得石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙醋相、正丁醇相和水相部分,進行防污活性檢測,發現除水相部分無防污活性外,其余4個部分均顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,其中正丁醇相不僅防污活性高(EC50=4.06μg/m L),對翡翠貽貝的毒性也低(半致死濃度(LC50)=158.11μg/m L),表明其中含有高效低毒的活性成分.研究結果為從海洋微生物中篩選獲得新型環保海洋防污劑奠定重要基礎.

海綿共附生細菌;防污活性;海洋防污劑;葉片山海綿

在海洋環境中,船舶、海水養殖網具及其他人工設施的表面易被海洋生物大量附著,造成生物污損問題,會導致船舶航行速度下降、油耗增加、堵塞網具網孔、加速金屬表面腐蝕等,對海洋運輸、海洋工程、海水養殖及海軍裝備都具嚴重危害[1].有機錫曾被作為海洋防污劑廣泛應用,但因其具劇毒而被禁用.目前主要使用氧化亞銅及異噻唑啉酮、三嗪類等防污劑,但研究表明,這些防污劑對非靶標的海洋生物具顯著的毒性作用,污染海洋環境,破壞生態平衡[2].因此,環境友好型海洋防污劑成為研發熱點.

海綿等海洋底棲生物的體表與海中非生物體的表面同樣面臨被生物污損的威脅.海洋底棲生物的體表若被污損,會妨礙其氣體和營養交換、阻礙生長、增加質量、競爭食物、造成組織破損、甚至會致死[3].因此,許多海洋底棲生物在長期進化過程中形成防污機制.其中,海洋底棲生物產生防污活性物質被認為是一種重要的防污機制[4],是發現環境友好型海洋防污劑先導化合物的潛在來源,但天然防污產物在生物體中的含量通常很低.有研究發現,一些海洋底棲生物的共附生微生物也具防污活性,其作用可能是協助宿主保持體表潔凈[5-6].微生物可通過大量培養發酵生產天然產物,有助于解決天然產物防污劑在產量上受到限制的難題,因此其研究受到學者重視.

翡翠貽貝(Perna viridis)是一種重要的海洋污損動物,它通過分泌足絲附著在海中人工設施的表面,造成生物污損.據報道[7],翡翠貽貝在海水養殖網箱上的密度可高達5.2 kg/m2,其在養殖網箱上生長不但增加網箱負荷,影響網箱的使用壽命,還會堵塞網眼,影響水流通暢,造成其他養殖種的產量和品質下降.

本文對采自廣東南澳的葉片山海綿(Mycale phyllophila)中的共附生細菌進行分離純化,以翡翠貽貝足絲產生抑制實驗,檢測共附生細菌發酵液提取物的防污活性,并進一步對所篩選出的高防污活性的發酵液提取物進行萃取分離,追蹤其活性部位,為研發新型環保海洋防污劑提供基礎資料.

1 材料與方法

1.1 菌株的分離純化

海綿樣品于2013年8月采自廣東南澳,由廈門大學海洋與地球學院王德祥副教授鑒定為葉片山海綿.海綿采集后冷藏并迅速運回實驗室進行菌株分離工作.在超凈臺中用無菌手術刀和鑷子將樣品切割成1 cm3大小組織塊,用無菌海水沖洗3次,以除去表面雜質和黏附的環境微生物.然后將組織塊在無菌研缽中充分研磨至勻漿狀,轉移至50 m L離心管,加入10 m L無菌海水,渦旋震蕩混勻后,在4℃、2 500 r/min條件下離心1 min,取1 m L上清液加入含9 m L無菌海水的離心管中,進行梯度稀釋,稀釋梯度為10ˉ1、10ˉ2和10ˉ3.吸取上述包括原液的所有梯度稀釋液100μL涂布于2216E培養基,置于28℃培養箱中培養2～3 d.挑取不同形態特征的單菌落,在平板上反復劃線分離純化,獲得純培養物.將各菌株以20%(體積分數)甘油為保護劑,于ˉ80℃下保種.

1.2 菌株16S r DNA PCR擴增和序列分析

采用菌落PCR手段,以通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACT-3′)[8]對所獲得細菌的16S rDNA序列進行PCR擴增,PCR產物經0.8%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至上海英俊生物技術有限公司進行測序.所測序列上傳至NCBI進行BLAST同源性比對分析,初步鑒定海洋微生物的歸屬.

1.3 菌株的接種發酵

將菌株接種到2216E固體培養基,28℃下培養1 d.在超凈臺中挑取單克隆菌落,接種于500 m L的2216E液體培養基中,于28℃、180 r/min條件下過夜培養.所得發酵液于4℃以9 000 r/min離心20 min,獲得上清發酵液.

1.4 發酵產物的提取

將收集到的上清發酵液用等體積的乙酸乙醋萃取3次,旋轉蒸發至干,獲得發酵液提取物.所有提取物4℃下保存于安培瓶中.

1.5 防污活性檢測

以翡翠貽貝足絲分泌抑制實驗檢測菌株發酵產物提取物的防污活性.翡翠貽貝(殼長15～20 mm)采自漳州漳浦沿岸.采集后將翡翠貽貝在實驗室內暫養1～2 d,使其適應實驗室環境.實驗前,輕柔剪去翡翠貽貝的足絲,備用.實驗時,以24孔板為實驗容器,將各提取物先分別溶于二甲亞礬(DMSO)中配置成0.1,1,10 mg/m L,然后取20μL各溶液加至含1.98 m L膜濾海水的各孔中,每孔中另加入1只翡翠貽貝.以含20μL DMSO的膜濾海水(1.98 m L)為對照組, (預實驗結果表明僅含純海水的空莊組與添加DMSO的對照組間,翡翠貽貝分泌的足絲數量沒有顯著差異,可見添加20μL DMSO對翡翠貽貝足絲分泌沒有顯著影響)各實驗組均設10個平行組.24 h后觀察翡翠貽貝足絲產生條數和存活情況.

1.6 防污活性菌株NAP7的形態觀察和生理生化特征測定

活性檢測實驗表明在所檢測的菌株中,以菌株NAP7提取物的防污活性最高,本文對此活性菌株進行進一步研究.將菌株NAP7接種于2216E固體培養基上,28℃培養3 d,觀察菌落形態,并用掃描電鏡LEO1530觀察其菌體形態特征,同時參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9]中的有關方法對其進行生理生化特征檢測.

1.7 防污活性組分的追蹤

活性檢測實驗表明菌株NAP7發酵產物的提取物對翡翠貽貝的防污活性高,且無毒性作用,本文通過萃取分離對此提取物進行防污活性部位的追蹤.將該菌株發酵產物的乙酸乙醋提取物以90%(體積分數,下同)甲醇溶解,用等體積的石油醚進行萃取,石油醚萃取液旋轉蒸發得到石油醚相部分;余下的90%甲醇部分經旋轉蒸發后,用10%甲醇再次溶解,先后用等體積的二氯甲烷、乙酸乙醋和正丁醇萃取,旋轉蒸發后得到二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相部分.余下的10%甲醇部分旋轉蒸發后得到水相部分.以上述翡翠貽貝足絲分泌抑制實驗檢測各部分的防污活性.

1.8 實驗數據的處理

應用Origin Pro 9.0軟件進行實驗數據統計處理和作圖,并采用SPSS 21.0統計軟件中的單因素方差分析(one way ANOVA)比較實驗數據的顯著性差異.以史丕曼-卡伯法[10]計算所檢測物質對翡翠貽貝足絲分泌的半抑制濃度(EC50)及半致死濃度(LC50).

2 結 果

2.1 菌株16S r DNA序列分析

從葉片山海綿中分離純化獲得7株共附生菌株,對這些菌株的16S r DNA序列進行PCR擴增和序列測定,并與NCBI的GenBank基因序列數據庫進行BLAST同源性比對,結果如表1所示.這7株菌株的16S rDNA序列均與數據庫中已知細菌的相關序列具有較高的相似性(≥99%),菌株分別屬于3個不同的屬,包括芽抱桿菌屬(Bacillus,5株)、假弧菌屬(Pseudovibrio,1株)、短桿菌屬(Brevibacterium,1株).

2.2 發酵產物提取物的防污活性

菌株發酵產物提取物對翡翠貽貝的防污活性檢測結果如圖1和表2、3所示.在這7株菌株中,以菌株NAP7的提取物得率最高,為222.4 mg/L.其中,菌株NAP1和NAP7的提取物均顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,其EC50分別為55.26和14.85μg/m L.所檢測的其余5株菌株NAP2～NAP6的提取物在1～100 μg/m L的質量濃度范圍內對翡翠貽貝足絲分泌均無顯著的抑制活性.同時,本文還觀察了在菌株發酵產物提取物作用下翡翠貽貝的死亡情況,檢測這些提取物的毒性作用,其結果如表2所示.這7株菌株的提取物在1～100μg/m L的質量濃度范圍內對翡翠貽貝均無強烈的致死活性,LC50均大于100μg/m L.其中,菌株NAP7的發酵產物提取物不僅得率高,防污活性高,且實驗組中個體沒有出現死亡,因此本文選取對此菌株的提取物進行進一步的防污活性部位追蹤.

2.3 菌株NAP7的形態特征和生理生化特征

菌株NAP7在2216E固體培養基中培養3 d后,菌落呈乳莊色,邊緣透明整齊,表面光滑.對菌株NAP7進行掃描電鏡分析,如圖2所示.該菌株呈桿狀,長為1.2～2.0μm,寬為0.3～0.5μm.

菌株NAP7的生理生化特征檢測結果如表4所示.參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9]和文獻[11],結合該菌的形態特征、生理生化特征和16S r DNA序列同源性比對結果,初步鑒定該菌為脫氮假弧菌(Pseudovibrio denitrificans).

2.4 菌株NAP7發酵產物提取物防污活性組分的追蹤

用不同極性的溶劑對菌株NAP7發酵產物提取物進行萃取,依次獲得石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙醋相、正丁醇相和水相部分,各部分得率及防污活性和毒性檢測結果如圖3和表5、6所示.其中,水相部分對翡翠貽貝足絲分泌無顯著的抑制作用,其余4個部分均顯著抑制翡翠貽貝足絲分泌,具防污活性.相較而言,石油醚相部分的防污活性較低,其EC50為234.02μg/m L,而二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相部分均顯示出較高的防污活性,EC50值均在5μg/ m L以下,小于原提取物的EC50值(14.85μg/m L),表明菌株NAP7發酵產物中的防污活性物質集中在這3個部分.此外,從表5和6可見,二氯甲烷相和乙酸乙醋相部分對翡翠貽貝具較高的毒性作用,其LC50值均小于5μg/m L;而正丁醇相部分對翡翠貽貝的毒性低,LC50高達158.11μg/m L.

3 討 論

海綿是天然活性物質的豐富來源,近年研究表明,許多從海綿中分離獲得的活性化合物其真正生產者不是海綿,而是海綿的共附生微生物[12].目前,從海綿的共附生微生物中發現生物活性物質是一個研究熱點.另一方面,海綿具固著濾食的生活習性,其體表須保持潔凈,一些共附生微生物所產生的活性物質可能會為海綿起到防御體表污損的生態作用.Dash等[13-14]檢測了7株海綿共附生菌株的防污活性,發現有4株菌株的發酵產物提取物具較好的防污活性,并進一步對其中一株活性高的菌株Winogradskyellaporiferorum的提取物進行分離純化,獲得了聚醚類天然防污產物.總體上,當前對海綿共附生微生物防污活性的研究報道還不多,但對包括海綿在內的海洋底棲生物的共附生微生物防污活性研究已引起了相關學者的重視,近年來陸續有文獻報道[5].本文以一種重要的海洋污損動物翡翠貽貝的足絲分泌實驗為檢測模型,對葉片山海綿共附生細菌的防污活性進行了研究,篩選出2株菌株NAP1和NAP7的發酵產物提取物具顯著的防污活性,表明這2株菌株有可能為葉片山海綿起到防污作用,另外也是發現環保型海洋防污劑先導化合物的潛在來源.

表1 分離菌株16S r DNA序列同源性比對結果Tab.1 Homology comparison of 16S r DNA sequences of the isolated strains

圖1 分離菌株發酵液提取物對翡翠貽貝足絲分泌的影響Fig.1 Effects of extracts from fermentation broth of the isolated bacteria on byssus thread production of P.viridis

表2 分離菌株發酵液提取物對翡翠貽貝存活的影響Tab.2 Effects of extracts from fermentation broth of the isolated bacteria on survival of P.viridis

表3 分離菌株發酵液提取物的得率及其對翡翠貽貝的防污活性和毒性Tab.3 Yield,antifouling activity and toxicity of extracts from fermentation broth of the isolated bacteria against P.viridis

圖2 菌株NAP7掃描電鏡圖Fig.2 The SEM picture of the strain NAP7

表4 菌株NAP7的生理生化特征Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of the strain NAP7

本文還對防污活性較高的菌株NAP7的提取物進行了活性部位追蹤,發現除了水相無防污效果外,石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相均具防污活性,表明菌株NAP7中可能含有不止一種天然防污活性物質,且活性物質為中低極性物質.此外,本文還發現該菌株提取物的二氯甲烷相、乙酸乙醋相和正丁醇相具高防污活性,EC50值小于5μg/m L,有進一步開發應用潛力.尤其是正丁醇相不僅防污活性高,毒性也低,表明其中含有高效低毒的活性成分.作者嘗試以GC-MS方法對菌株NAP7的提取物進行初步分析,發現可能含有硅氧烷類、呋喃醇、生物堿類和甾醇類化合物.下一步將應用色譜分離純化方法從菌株NAP7中篩選防污活性化合物.

圖3 菌株NAP7提取物不同極性部分對翡翠貽貝足絲分泌的影響Fig.3 Effects of fractions with different polarity from the extract of the strain NAP7 on byssus thread production of P.viridis

表5 菌株NAP7提取物不同極性部分對翡翠貽貝存活的影響Tab.5 Effects of fractions with different polarity from the extract of the strain NAP7 on survival of P.viridis

表6 菌株NAP7提取物不同極性部分的得率及其對翡翠貽貝的防污活性和毒性Tab.6 Yield,antifouling activity and toxicity of fractions with different polarity from the extract ofthe strain NAP7 against P.viridis

結合形態觀察、生理生化特征和16S r DNA序列比對,將菌株NAP7初步鑒定為脫氮假弧菌.有學者在其他海綿種類中也曾分離出與脫氮假弧菌有較高同源性的菌株,且發現其具抗菌活性[15-16].另外,在軟珊瑚Sarcophyton sp.共附生微生物中也發現了與脫氮假弧菌有較高同源性的菌株,具抑制海洋污損細菌生長的活性[17].本文則檢測出菌株NAP7對翡翠貽貝足絲分泌具顯著的抑制活性.在接下來的工作中可檢測該菌株對其他污損生物的附著是否也具抑制作用,觀察其是否具廣譜防污活性.

傳統的有機錫和氧化亞銅等重金屬防污劑不僅對生物有毒性作用,且在環境中難降解,而天然防污活性物質具生物可降解性,有利于保持生態平衡,可望替代對環境有害的防污劑,是獲得新型環保防污劑的重要來源.目前,天然防污活性物質的主要篩選生物源包括海洋底棲無脊椎動物[18-19]、海洋藻類[20]和海洋微生物[21].與前兩者相比,微生物可通過發酵工程技術規模化生產活性物質,因此防污活性功能菌株在海洋環保防污技術領域具較大的開發利用潛力,值得深入研究.

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Study on Antifouling Activity of Bacteria Associated with Marine Sponge Mycale phyllophila

CHEN Zhi-ying,WANG Xiang,SU Pei,FENG Dan-qing*,KE Cai-huan
(College of Ocean&Earth Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

:Seven bacterial strains were isolated from marine sponge Mycale phyllophila.Based on comparative analysis of their 16S r DNA sequences,five strains were affiliated to the genus Bacillus,one to the genus Pseudovibrio,and one to the genus Brevibacterium.And then,they were subjected to fermentation and the extracts of culture broth were tested for antifouling activity using the bioassay of byssus thread production with the green mussel Perna viridis.The results showed that the extracts of the bacterial strains NAP1 and NAP7 significantly inhibited byssus thread production of P.viridis,with EC50of 55.26 and 14.85μg/m L,respectively. The extracts of the other five strains had no antifouling activity.Additionally,the extract of the strain NAP7 were further investigated for its active fraction.It was separated with solvents of different polarities.Petroleum ether fraction,methylene dichloride fraction,ethyl acetate fraction,n-butanol fraction and water fraction were obtained successively and then tested for antifouling activity. Although there was no antifouling activity in the water extract,the other four fractions significantly inhibited byssus thread production of P.viridis.Especially,the n-butanol fraction was highly antifouling active(EC50=4.06μg/m L)and not very toxic(LC50= 158.11μg/m L),indicating that this fraction contained substance(s)with high antifouling activity and low toxicity.The findings of this study are important for screening environmentally friendly marine antifoulants from marine microorganisms.

sponge-associated bacteria;antifouling activity;marine antifoulants;Mycale phyllophila

P 745

A

0438-0479(2015)03-0340-07

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.008

2014-10-22 錄用日期:2015-01-20

國家自然科學基金(41106121);海洋公益性行業科研專項(201305016);廈門市海洋經濟創新發展區域示范重點項目(12PZB001SF09);廈門大學海洋科學基地科研訓練及科研能力提高項目(J1210050)

*通信作者:dqfeng@xmu.edu.cn

陳志穎,王祥,蘇培,等.葉片山海綿共附生細菌的防污活性研究[J].廈門大學學報:自然科學版,2015,54(3): 340-346.

:Chen Zhiying,Wang Xiang,Su Pei,et al.Study on antifouling activity of bacteria associated with marine sponge Mycale phyllophila[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):340-346.(in Chinese)