一種海洋領鞭毛蟲的分離與鑒定

賈曉燕,熊 源,黃凌風,林施泉,陸家昌,吳林南,李 玲

(1.廈門大學海洋與地球學院,2.廈門大學環境與生態學院,福建廈門361102)

一種海洋領鞭毛蟲的分離與鑒定

賈曉燕1,熊 源1,黃凌風2*,林施泉1,陸家昌1,吳林南1,李 玲1

(1.廈門大學海洋與地球學院,2.廈門大學環境與生態學院,福建廈門361102)

采用微液滴操作法在廈門海域分離培養了一株海洋鞭毛蟲C6,運用顯微鏡觀察和18S r DNA基因技術鑒定其種類,并將其與GenBank中已知的14種海洋鞭毛蟲18S rDNA序列比較,用NJ法和UPGMA法構建系統發育樹.通過PCR擴增獲得1 774 bp 18S r DNA序列,與NCBI已登陸的其他同源序列進行系統分析,結果顯示此海洋鞭毛蟲屬于領鞭毛蟲(choanoflagellates).與已知種Monosiga brevicollis的相似性為99%,為進一步研究該種鞭毛蟲提供了遺傳背景,但要明確其種類還需其他研究佐證.

海洋鞭毛蟲;分離;18S r DNA;分子鑒定

異養鞭毛蟲(heterotrophic flagellate)在海洋中分布廣泛,從河口區到大洋區,從熱帶到極地海域,都能發現其存在[1].異養鞭毛蟲是重要的細菌捕食者,能通過攝食作用影響細菌的群落組成,是海洋微食物環的重要組成部分,在海洋生態系統物流、能流中發揮著重要作用[2].在鞭毛蟲分布調查中,領鞭毛蟲(choanoflagellates)是常見的海洋異養鞭毛蟲[3],領鞭毛蟲的領由一圈偽足組成,捕食的時候利用一根鞭毛激起水流,通過領來過濾懸浮顆粒物——主要是細菌.這個類群的種類很多,它們之間的形態略為不同,依靠細胞覆蓋物的形狀和組成來區分.作為與后生動物最接近的單細胞生物,領鞭毛蟲具有重要的進化地位,但對領鞭毛蟲的分子發育系統研究仍然有限[4].由于海上調查條件有限,不易對其進行分離培養,且鞭毛蟲個體微小,普通光學顯微鏡下難以通過形態觀察進行準確分類.

本研究采用微液滴操作法在廈門附近海域分離并純化一種海洋鞭毛蟲,借助顯微鏡初步判斷為領鞭毛蟲,進一步利用18S r DNA序列的擴增和測序分析,并與Genbank中已知種類進行比對,確定其種類.目前關于海洋鞭毛蟲的研究,大部分是以一個“黑箱”來處理,因此,我們對該鞭毛蟲的分離與鑒定不僅有助于揭示異養鞭毛蟲的種類組成及遺傳背景研究,對進一步研究異養鞭毛蟲的生態作用有積極意義.

1 材料與方法

1.1 材 料

本實驗所用海洋鞭毛蟲是由廈門大學海洋生態學實驗室在廈門大學附近海域分離培養得到的單種株(C6).Taq酶等PCR所需試劑購自TakaRa公司;凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)與其他生化試劑均購自上海生工生物股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 鞭毛蟲的分離純化

微液滴操作法[5]:用自制毛細管從天然海水中吸取微量液體在顯微鏡下確認液滴中鞭毛蟲的數量,如只有一個鞭毛蟲,利用吸管的毛細作用重新吸回液滴,并轉移到預先備好的培養液中.將挑好的個體放在20～25℃下培養,培養液為添加酵母提取物(終質量分數為0.01%)的過濾海水,并接種從海水中分離的細菌作為異養鞭毛蟲的食物.培養約3～4 d后取樣在400和1 000倍顯微鏡視野下觀察,確認是否成功分離出純種.異養鞭毛蟲的細胞外觀、鞭毛數量和形態、游泳行為作為是否為純培養的判斷依據.通常分離2～3次后能達到純化的效果.

1.2.2 顯微鏡樣品處理

取1 m L處于指數生長期的鞭毛蟲培養液,加入10μL Lugol′s試劑固定,在Leica FW4000熒光顯微鏡下觀察其形態特征.

取10 m L經戊二醛固定的樣品,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,最終質量濃度為5μg/m L)染色10 min后,低壓(＜20 kPa)過濾到0.22μm的Millipore黑膜上,在紫外和藍色激發光下利用顯微鏡觀察其形態特征.

1.2.3 總DNA的提取和PCR擴增

取單種培養的鞭毛蟲培養液2 m L,離心棄上清.用酚-三氯甲烷方法[6]提取總DNA.

PCR擴增引物見表1.擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,30個循環;72℃延伸10 min.PCR擴增結果用1%(質量分數,下同)瓊脂糖進行電泳檢測.

表1 PCR擴增引物[7]Tab.1 Primers used in this study[7]

1.2.4 PCR產物的克隆和測序

將PCR產物用上海生工凝膠回收試劑盒回收后,將目標片段連接到質粒載體PMD18-T上,轉入細菌DH5α.測序由南京金斯瑞公司完成.

1.2.5 序列分析

在NCBI服務器上用Nucleotide Blast進行同源檢測,將測得的序列和其他相關鞭毛蟲序列,用計算機軟件進行計算分析.應用Clustal X 1.83進行多序列對位分析,應用MEGA 3.1軟件NJ法和UPGMA法建立系統樹,用Maximum Composite Likelihood計算遺傳距離值,重復1 000次計算bootstrap值,節點數值表示1 000次重復抽樣所獲得的自檢支持百分率.

2 結 果

2.1 鞭毛蟲的形態學特征

在光學顯微鏡下(1 000×)該類鞭毛蟲細胞體呈梨形(見圖1(a)),細胞長軸3～5μm,一根長鞭毛,長度是體長的1～2倍.該鞭毛蟲多營自由生活,常單細胞生活,不與相同種類的其他個體形成群體(見圖1 (a)和(b)).在光學顯微鏡下,不易觀察其領狀結構.該類鞭毛蟲無色素,在熒光顯微鏡下觀察,藍色激發光下未見有紅色發光(葉綠素特征,見圖1(c)),因此可以斷定該類群鞭毛蟲是異養鞭毛蟲.該鞭毛蟲運動方式以直線運動為主,可通過螺旋式旋轉來改變運動方向,在水體中主要營浮游生活.

圖1 在顯微鏡下觀察此鞭毛蟲Fig.1 The observation of this flagellate under the optical microscope

2.2 18S r DNA序列的擴增和序列分析結果

對C6基因組DNA(見圖2(a))使用真核生物18S r DNA通用引物,PCR擴增得到的目的片段(見圖2 (b)),經過1%瓊脂糖電泳分析,DNA片段為1 700 bp左右.由測序結果得知目的片段為1 774 bp, G和C所占比例為45.77%.將該18S r DNA序列(Genbank登陸號為KM387288)進行BLAST搜索,序列覆蓋度在90%以上的同源性序列100條,最大序列相似度(maximum identification)在90%以上的有38條,其中與Monosiga brevicollis的18S r DNA相似度最高,達到99%.

圖2 DNA提取電泳結果(a)和PCR電泳結果(b)Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of total DNA(b)and 18S rDNA(b)

用MEGA3.1軟件按照NJ法(圖3)和UPGMA兩種方法構建系統發育樹.用兩種方法建立的系統發育樹樹形幾近相同,而且在每個系統發育樹中C6與Monosiga brevicollis的節支點的支持率都很高,分別為99(NJ法)和100(UPGMA法).從本實驗所構建的系統發育樹可知,這15種鞭毛蟲主要分成兩簇.一簇主要由領鞭毛蟲(Monosiga brevicollis和Monosiga ovata Hoglet),雙并鞭類(Uncultured bicosoecid,Siluania monomastiga和Neobodo designiss)以及分類地位不明確的Pleurostomum flabellatum組成;一簇主要由波豆類(Bodo caudatus和Rhynchomonas nasuta)和分類地位不明確的種類(Dysnectes brevis和Dimastigella trypaniformis)組成以及一種Placididea,一種雙并鞭類和一種隱藻類.為進一步分析此種與其他鞭毛蟲的親緣關系,將所有序列用MEGA3.1計算它們之間的遺傳距離值.C6與已知的14中鞭毛蟲的遺傳距離為0.296～6.536,其中與Monosiga brevicollis的遺傳距離最小,為0.296.

3 討 論

將C6的序列與基因庫中已知的14種海洋鞭毛蟲序列進行比較可知與本種最接近的是Monosiga brevicollis,用Kimura 2-parameter計算C6與Monosiga brevicollis遺傳距離值,重復1 000次計算bootstrap值為0.282,小于0.3,小于種間遺傳距離的范圍,二者應為同一種.從形態學上觀察,此鞭毛蟲為單細胞生長,細胞大小為3～5μm,這與Atkins的研究結果[8]一致.Atkins報道[8]Monosiga brevicollis大小為3～7μm,但是該報道中長鞭毛的長度為5倍體長,而此種為1～2倍體長.長鞭毛長度差異的存在可能是在Lugol′s或戊二醛試劑固定時,長鞭毛脫落或損傷造成的.通過以上形態學和分子生物學分析推測,C6應為領鞭毛蟲的Monosiga brevicollis.在光學顯微鏡下觀察不易發現領狀結構,有待于電鏡結果佐證.

領鞭毛蟲是世界性廣布種,從海洋到淡水,從極地海域到熱帶海域都有其種類報道[9-12].有研究表明領鞭毛蟲主要以細菌為食,同時也是海洋微型浮游生物和有機碎屑的初級消費者,因此領鞭毛蟲的豐度與同群落中的其他微微型浮游生物關系密切,且領鞭毛蟲的密度與初級生產力成正相關,這就決定了領鞭毛蟲在微食物環和碳循環過程中的重要作用[9].但是領鞭毛蟲的系統分類地位一直是個爭論的問題.Levine等[13]1980年確定它隸屬于原生動物亞界,肌鞭毛門,動鞭毛綱,領鞭毛目.1991年Patterson等[3]從鞭毛蟲的形態和功能作用對異養鞭毛蟲重新定義,領鞭毛蟲即為其中一類.產生這種分類結果的原因可能是由于之前有關海洋鞭毛蟲的研究較少,在基因庫中能搜索到的,可用比較的序列有限.不過從已有結果可知,領鞭毛蟲與雙并鞭類的親緣關系較近.Monosiga brevicollis是多細胞動物現存最近的單細胞親緣種,同時它也被看做是連接真菌與多細胞生物之間的重要紐帶.King等[14]2008年發表了Monosiga brevicollis的基因組系列研究表明,該基因組具有富含內含子(intron)的基因,它們是一些編碼蛋莊區域,其特征是與細胞黏附及動物的細胞外基質相關.因此對海洋領鞭毛蟲尤其是Monosiga brevicollis的深入研究有助于了解多細胞生物的起源.本研究從海水中分離純化得到一種鞭毛蟲,從形態學和核酸序列進行分析,顯示此種應為Monosiga brevicollis,從而為研究其生理生態特征,及進一步進行開發利用等提供了遺傳背景.

圖3 單種C6及其相關屬種18S r DNA序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of C6 and other relative species based on 18S r DNA

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Morphological and Molecular Identification of a Marine Flagellate

JIA Xiao-yan1,XIONG Yuan1,HUANG Ling-feng2*, LIN Shi-quan1,LU Jia-chang1,WU Lin-nan1,LI Ling1
(1.College of Ocean&Earth Sciences,Xiamen University, 2.College of the Environment&Ecology,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

:Using microscope and 18S r DNA techniques,a strain of nanoflagellate(C6)separated in Xiamen Bay was identified and analyzed.One 1 774 bp fragment of 18S rDNA was amplified from the strain C6.Homology analysis between the yielded sequence and the 18S r DNA sequences accessed in the National Center for Biotechnology Information(NCBI)from other strains showed that C6 belonged to choanoflagellates,which shared 99%homologue with the known species of Monosiga brevicollis.Choanoflagellates play a very important role in biological evolution and marine ecology,however,molecular phylogenetic studies within choanoflagellates are still extremely limited.According to results of morphological and DNA sequence analysis,we consider that C6 should be Monosiga brevicollis,but more collaborations are still required for specific identification.This study provides basic genetic information for further study of physiological characteristics and ecological functions of the strain C6 in Xiamen Bay.

marine flagellate;isolation;18S r DNA;molecular identification

Q 945.11

A

0438-0479(2015)03-0436-04

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.025

2014-05-06 錄用日期:2015-01-13

國家自然科學基金(41376131);國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2011CB409804)

*通信作者:huanglf@xmu.edu.cn

賈曉燕,熊源,黃凌風,等.一種海洋領鞭毛蟲的分離與鑒定[J].廈門大學學報:自然科學版,2015,54(3):436-439.

:Jia Xiaoyan,Xiong Yuan,Huang Lingfeng,et al.Morphological and molecular identification of a marine flagellate[J]. Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):436-439.(in Chinese)