Flanders病毒TaqMan RT-PCR檢測方法的建立

李 浩，赫曉霞，曹玉璽，聶 凱，劉 巖，何 英，高曉艷，付士紅，王環宇

Flanders病毒TaqMan RT-PCR檢測方法的建立

李 浩1，赫曉霞1，曹玉璽1，聶 凱1，劉 巖2，何 英1，高曉艷1，付士紅1，王環宇1

目的 應用TaqMan PCR技術建立針對Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的實時熒光定量PCR檢測方法。方法 下載GenBank中FLAV基因序列資料并進行多序列比對分析，選擇其L基因中的高保守序列片段進行FLAV特異引物與探針的設計，使用來自于不同科屬的15株病毒驗證方法特異性，通過重復/平行實驗驗證方法穩定性，并利用體外轉錄的L基因RNA標準品建立基因拷貝數絕對定量分析模型。結果 引物與探針工作特異性良好，同一樣品重復檢測Ct值的變異系數均小于1.7%，定量分析模型靈敏度達到100 copies/PCR。結論 建立完成針對FLAV的TaqMan PCR檢測方法。實驗結果顯示，本方法具有高特異性、高敏感性、高穩定性、簡便、易操作的特點，為今后對FLAV的檢測、監測及相關研究提供技術手段。

Flanders病毒；TaqMan RT-PCR;分子檢測

Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，但目前還未進行明確分類[1]。FLAV是一種單股負鏈的RNA病毒，庫蚊是其最主要的傳播媒介，主要的宿主為野生鳥類，其首次被發現于1961年，以發現地“Flanders”命名[2-4]。“Flanders”是位于美國紐約州的一個小村莊，因為擁有相對較長的海岸線，成為蚊子理想的棲息地[2,5]。Flanders病毒的抗原反應與Hart Park病毒(Hart Park virus，HPV)較為接近，但又有所不同[3]。目前人類對FLAV感染人體后所造成的特異性臨床癥狀，還沒有確切的認識。因此，人類對該病毒感染和傳播的預警尤為困難。

雖然，我國目前尚未發現FLAV的感染與傳播，但隨著我國社會經濟的發展和日益增多的國際交流與合作，一些國外其他地區流行的疾病與病原體傳入我國的風險日益增高。根據美國經驗顯示，FLAV在其東部不少地方的蚊媒監測中出現的頻率，要高于其它常見的致病性蟲媒病毒，如西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)等。所以理論上，FLAV完全可以作為WNV等蟲媒病毒哨點監測的對象，建立針對FLAV的監測與檢測能力，可以有效提高我國對外來蟲媒病毒病的發現和預警能力。本研究利用TaqMan PCR技術建立針對FLAV的Realtime PCR方法，具有高特異性、高敏感性、高穩定性、簡便、易操作的特點，為今后對FLAV的檢測、監測及相關研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 引物、探針的設計 選擇GenBank發表的全部2株FLAV中L基因序列進行全基因序列比對，根據TaqMan PCR引物、探針設計原則[6]，選擇最為保守的區域作為擴增的目標基因片段。在此區域內利用Primer Express 3.0輔助設計引物及探針序列，并通過Blast分析驗證其廣譜性和特異性。引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探針由上海生工生物工程有限公司合成并標記，探針5′、3′端分別標記FAM熒光報告基團和TAMRA熒光淬滅基團。

1.2 FLAV陽性質粒標準品的合成及體外轉錄 根據引物及探針位置，設計合成FLAV中L片段基因高度保守區域(4774-4849)作為檢測目標片段，并克隆至PGEM-Teasy載體中，基因合成與質粒克隆由北京梓熙生物科技有限公司完成。對克隆質粒中目標片段進行普通PCR擴增后，進行回收和純化(TaKaRa公司GoTaq Green Master Mix，QIAgen公司Gel Extraction Kit)，再通過紫外核酸蛋白定量儀對回收的線性化DNA模板進行定量，用RiboMAX Large Scale RNA Production System T7(Promega公司)進行RNA體外轉錄并回收，回收的RNA通過紫外核酸蛋白定量儀進行定量，根據RNA序列的分子量進行濃度換算。以上實驗操作均按照試劑盒要求進行。

1.3 TaqMan PCR檢測體系的建立 通過優化，建立體積為25 μL/管的TaqMan PCR反應體系。反應體系組成：10 μmol/L的上下游引物與5 μmol/L的探針各1 μL，2×Reaction Buffer 12.5 μL和Enzyme Mix 1 μL(ABI公司，AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit)，RNA模板1 μL，剩余由DEPC水補齊。使用Mx3000P Real Time System(STRATAGENE公司)進行擴增。擴增條件為：45 ℃反轉錄10 min，95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s，40個擴增循環。

1.4 檢測體系的特異性評價 利用本實驗室儲存的5科11種15株病毒的RNA與FLAV陽性質粒體外轉錄的RNA為模擬樣本，進行FLAV Taqman RT-PCR檢測體系的特異性驗證。15株病毒信息如下：登革熱病毒血清1-4型各1株、西尼羅病毒1株、乙型腦炎病毒基因1型和3型各1株、蜱傳腦炎病毒1株、庫蚊黃病毒1株，彈狀病毒科狂犬病病毒1株，布尼亞病毒科Tahyna病毒1株、巴泰病毒1株，披膜病毒科甲病毒屬蓋塔病毒1株，呼腸孤病毒科版納病毒1株和遼寧病毒1株。

1.5 檢測體系標準曲線的繪制 使用RQ1 DNase對FLAV陽性質粒體外轉錄所得RNA進行消化，去除殘留DNA后，利用紫外核酸蛋白定量儀對轉錄所得RNA進行定量，按照公式(6.02 ×1023)×(轉錄產物濃度ng/μL)/(轉錄產物RNA分子量)=copies/μL計算RNA拷貝數。通過系列稀釋，獲得101～104copies/μL 的4個不同濃度梯度的樣品，進行Taqman PCR擴增與分析。根據不同濃度樣品拷貝數和循環閾值(Ct)的對應關系繪制出定量標準曲線。

1.6 檢測體系穩定性實驗 對所獲得的FLAV標準品，進行10-1～10-4梯度稀釋，獲得濃度分別為6×106～6×103copies/μL的4個不同濃度的RNA樣品，以此為模板進行4次平行重復實驗，對實驗所獲得的Ct值進行統計學分析，計算每個樣品4次實驗中Ct值的平均值(Mean)、標準差(S.D.)與變異系數(CV)，用以評價該檢測體系的穩定性。

2 結 果

2.1 FLAV特異的引物與探針 設計合成的FLAV特異性引物與探針序列信息見表1，擴增目標片段長度為74 bp。

2.2 檢測體系特異性 如圖1所示，僅有FLAV的RNA得到成功擴增，其他毒株均無陽性擴增信號。

2.3 檢測體系標準曲線 獲得檢測體系標準曲線方程為Y=-3.428×LOG(X)+41.25，R2=1.000。所建立方法最低檢測限(LOD)為：100 copies/PCR。見圖2。

2.4 檢測體系穩定性 如表2所示， 各樣品平行重復實驗Ct值的標準差S均<0.5，變異系數CV均<1.7%，表明該檢測體系穩定性良好。

表1 熒光定量PCR檢測FLAV的引物與探針序列信息

注：引物和探針在基因組中的核酸位點依據的是FLAV毒株 61-7484(GenBank號為AF523199)序列。

Note: All the primers and probe were designed based on the whole sequence of 61-7484 strain FLAV (GenBank Accession: AF523199).

注：1-4分別為登革熱病毒血清1-4型，5為西尼羅病毒，6-7分別為乙型腦炎病毒基因1型和3型，8為蜱傳腦炎病毒，9為庫蚊黃病毒，10為狂犬病病毒，11為Tahyna病毒，12為巴泰病毒，13為蓋塔病毒，14為版納病毒，15為遼寧病毒。

圖2 FLAV病毒基因拷貝數定量分析標準曲線

3 討 論

FLAV全基因組自3′-5′端，依次排列著N、P、U1、U2、U3、M、G、SH和L片段[4]。其中N、P、M、G和L為結構基因，分別編碼核蛋白、磷蛋白、基質蛋白、糖蛋白和L大蛋白。在GenBank中收錄的全部FLAV基因序列中，與結構蛋白相關的寥寥無幾，其中最多的為L基因序列，一共2條。本研究選擇了相對較為保守的L基因序列進行比對分析，鎖定L基因序列中最為保守的區域作為擴增目標片段。全部實驗結果表明，所建立的針對FLAV L基因的一步法TaqMan RT-PCR檢測方法具有較高的特異性、穩定性和敏感性，并可以達到最低100copies/PCR的檢測限值。

表2 FLAV檢測體系重復穩定性實驗數據

FLAV雖然已被人類發現了50余年，但公開發表的研究性論文卻極其有限，至今未能在彈狀病毒科內明確分類，且對人類感染所造成的疾病和臨床癥狀均無明確記載。僅從現有資料可知，彈狀病毒科除去植物病毒外，引起動物感染的病毒主要包括水泡性病毒屬、狂犬病病毒屬、短暫熱病毒屬和粒外彈狀病毒屬的病毒等。FLAV雖未歸至上述各病毒屬，但其感染復制特性具有本科病毒的普遍特征。從另一個角度來看，可能正是由于FLAV在人類社會中感染造成的影響及危害相對有限，傳播地域也僅限于有報道的布局地區，所以未能得到更多的關注與研究。

FLAV在分離與鑒定時，若采用常規的分離培養方法耗時較長，且對標本質量要求較高，尤其對于病毒載量極低或無活病毒的標本基本無效。本研究所建立的病毒檢測方法，是針對FLAV基因組RNA的一步法TaqMan PCR，可直接以FLAV基因組RNA為模板，提取后直接檢測并實時觀察結果，不僅耗時短，而且不易污染，相對傳統方法更加特異、敏感和定性，通過簡便的操作就可以對FLAV進行定性和定量。

TaqMan PCR技術是當今應用最為廣泛的Real-time PCR方法之一，相對其他的實時熒光定量檢測方法具有更高的特異性，其利用特異性熒光探針在PCR過程中所產生的熒光信號，動態收集熒光信號強度，通過熒光強度的變化進行定性和定量分析，具有檢測范圍廣、敏感度高、更為特異，且省時省力、無需電泳、減少污染等特點，適用于標本量較大的流行病學調查和實驗室篩查工作[7-9]。本研究建立的FLAV TaqMan PCR檢測方法，不僅可用于實驗室的臨床診斷，還將為今后更加高效的開展FLAV監測及研究工作提供良好的技術支持。

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Establishment of TaqMan RT-PCR assay for Flanders virus

LI Hao1,HE Xiao-xia1,CAO Yu-xi1,NIE Kai1,LIU Yan2,HE Ying1,GAO Xiao-yan1,FU Shi-hong1,WANG Huan-yu1

(1.InstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC,Beijing102206,China; 2.HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China)

The Flanders virus (FLAV) is a number of familyRhabdoviridae, contains a single-stranded, negative-sense viral RNA. Here we describe a molecular detection method developed for fast measurement of FLAV based on Taqman RT-PCR method. In this study, FLAV specific primers and probe were designed based on the FLAV L gene sequences published in GeneBank. Quantitative standard curve of FLAV TaqMan PCR was also successfully established. The specificity and stability test showed that the system is specific and the coefficient variables were all less than 1.7%. Quantitative standard curve based on the genomic copy was drawn, and the lowest detectable limit (LOD) of system was 100 copies/PCR, with higher sensitivity and stability than that of the conventional RT-PCR assay targeting the same gene.

Flanders virus; TaqMan RT-PCR; Molecular detection

Wang Huan-yu, Email:rainoffall@yahoo.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.005

國家科技重大專項項目(No.2013ZX10004-101)(李浩、赫曉霞對本文同等貢獻)

王環宇，Email：rainoffall@yahoo.com

1.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京 102206； 2.哈爾濱醫科大學，哈爾濱 150086

R373.9

A

1002-2694(2015)03-0212-04

Supported by the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2013ZX10004-101)

2014-10-23；

2014-11-27