細粒棘球蚴自發熒光觀察及光譜特征分析

楊 寧，張 雪，張傳山，呂國棟，李 亮，劉歡元，王 慧

細粒棘球蚴自發熒光觀察及光譜特征分析

楊 寧，張 雪，張傳山，呂國棟，李 亮，劉歡元，王 慧

目的 研究細粒棘球蚴的自發熒光現象及共聚焦λ掃描特點，豐富細粒棘球蚴光譜學和生物學信息，為后期免疫熒光及醫學光子學研究奠定基礎。方法 采集自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟,在無菌條件下收集包囊內的原頭蚴進行體外培養，亞甲基藍染色確定原頭蚴活力。激光掃描共聚焦顯微鏡下分別以405 nm、488 nm、514 nm、561 nm等不同激發光激發觀察蟲體自發熒光，并分別對這5種激發光激發的細粒棘球蚴做自發熒光λ掃描分析，同時采用全波長多功能酶標儀下分別以405 nm、488 nm、514 nm、563 nm、633 nm等5種激發光激發細粒棘球蚴，繪制其自發熒光曲線。結果 經亞甲基藍染色測定原頭蚴活力為100%。共聚焦顯微鏡觀察不同激發光照射下細粒棘球蚴蟲體能發出多種不同顏色的自發熒光。在相同的激發強度及探測器電壓的情況下，以405 nm激光激發的藍色熒光效果最佳，蟲體大體結構清晰；λ掃描分別以405 nm、488 nm、514 nm、561 nm、633 nm等5種激發光激發樣品，相應敏感的發射波長分別為490～520 nm、520 nm及580 nm左右、580～600 nm、610～630 nm和650 nm左右，其中405 nm、488 nm和561 nm激發效果較好，514 nm、633 nm激發效果欠佳。全波長多功能酶標儀檢測細粒棘球蚴做自發熒光曲線與共聚焦顯微鏡結果基本一致，但所測定的蟲體自發熒光強度較共聚焦顯微鏡偏低。結論 激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到細粒棘球蚴蟲體自發熒光，其中以405 nm激發的藍色熒光最強；細粒棘球蚴蟲體自發熒光光譜較寬，490～520 nm、610～630 nm，405 nm、488 nm和561 nm為較適宜的激發波長。

細粒棘球蚴；自發熒光；共聚焦顯微鏡

包蟲病又稱棘球蚴病，是棘球絳蟲寄生于人體及某些動物體內所致的一種人獸共患慢性寄生蟲病，嚴重危害人民身體健康和畜牧業的發展。根據多地的醫院資料統計，人體包蟲病中大約97%是由感染細粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus, Eg)引起的囊性包蟲病(Cystis Echinococcosis, CE)，而泡型包蟲病不超過3%[1]。目前，囊型包蟲病的治療以外科手術為主，藥物為輔，但手術對人體損傷大且復發率高，長期服用阿苯噠唑等藥物可產生嚴重的不良反應，針對細粒棘球蚴的候選抗原分子誘導的保護效果仍不夠理想。因此，通過對細粒棘球蚴的自發熒光特性的研究和分析進一步發現其在免疫學水平或醫學光子學的變化規律，對于研發新的檢測或治療方法是非常必要的。

自發熒光是一種物理現象，當用一種波長的光(如紫外線)照射某物質時，這種物質會在極短的時間內發射出較照射波長的光(可見光)，這種光被稱為自發熒光。組織經物理或化學脅迫后發出的自發熒光，稱為誘導自發熒光；而固有的非脅迫的自發熒光稱為自然自發熒光。現今關于生物組織自發熒光的研究多集中在植物學[2]。在醫學領域，自發熒光的研究目前主要集中在視網膜疾病和惡性腫瘤的輔助診斷領域[3-5]，有關動物組織自發熒光的研究較少[6]。目前，國內外關于棘球絳蟲及棘球蚴組織的自發熒光尚未見報道。隨著近年來生物醫學光子學的驟然興起，亟待開展該領域相關研究工作。本研究借助全波長多功能酶標儀和激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)對細粒棘球蚴蟲體的自然自發熒光(以下簡稱自發熒光)特性進行描述和分析，為后期免疫熒光及醫學光子學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑及耗材 徠卡TCS-SP8激光掃描共聚焦顯微鏡、賽默飛世爾Varioskan Flash全波長多功能酶標儀。細粒棘球蚴培養液組分：改良型RPMI-1640培養基(購自Hyclone公司，貨號SH30809.01B)、胎牛血清(FBS，購自Hyclone公司，貨號SV30184.01)、酵母(yeast extract,購自OXOID公司，貨號LP0021)、葡萄糖(D-glucose anhydrous，購自Solarbio公司，貨號G8150)、磷酸鹽緩沖液(PBS，購自Hyclone公司，貨號SH30256.01B)。所有培養基組分均通過0.22 μm濾器過濾除菌。玻底小皿(購自NEST公司，貨號801001)、96孔細胞培養板(購自Costar公司，貨號3599)。

1.2 細粒棘球蚴的分離培養 細粒棘球蚴包囊采自新疆烏魯木齊市屠宰場包蟲自然感染細粒棘球蚴的新鮮綿羊肝臟，從完整的包囊中，無菌條件下抽取囊液，分離原頭蚴(PSC)[7]，經胃蛋白酶37℃消化15～30 min，用無菌PBS洗3遍后，待其自然沉淀，將上清盡量棄去，亞甲基藍染色鑒定蟲體活力，計數后按2000 PSCs/mL密度進行培養。

1.3 自發熒光的共聚焦成像 取適量PSC于玻底小皿中，在共聚焦顯微鏡下分別通過藍色(DAPI通道，激發波長405 nm，檢測波長430～550 nm)、綠色(FITC通道，激發波長488 nm，檢測波長500～550 nm)、黃色(EYFP通道，激發波長514 nm、檢測波長525～600 nm)、紅色(TRITC通道、激發波長561 nm、檢測波長570～700 nm)4個通道進行拍攝，各通道拍攝參數均保持一致，分別為Zoom factor 放大系數1.00，掃描頻率200 HZ，Line average 3次，激光強度50%，采用HyD探測器進行信號檢測，探測器電壓200%。

1.4 自發熒光變化曲線的共聚焦測定 利用玻底小皿在共聚焦顯微鏡下以5種激發光激發細粒棘球蚴做自發熒光λ掃描分析繪制自發熒光曲線。①激發波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發波長633 nm，檢測波長650～750 nm。各通道掃描參數均保持一致，分別為Detection band width 20 nm，λ-Detection stepsize 20 nm，Line average 3次，掃描頻率600 HZ，激光強度50%，采用HyD探測器進行信號檢測，探測器電壓200%并根據蟲體形態劃定ROI。

1.5 自發熒光變化曲線的全波長多功能酶標儀測定 利用96孔板在全波長多功能酶標儀下以5種激發光激發細粒棘球蚴繪制自發熒光曲線。①激發波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發波長633 nm，檢測波長650～750 nm。各通道掃描參數均保持一致，分別為Measurement time 1000 ms，Excitation band width 5 nm，Optics模式為Bottom，每孔約為1 000個原頭蚴左右，2次重復。

2 結 果

2.1 細粒棘球蚴的分離培養 對新鮮采集的細粒棘球蚴進行亞甲基藍染色鑒定蟲體活力并計數，結果顯示蟲體活力為100%，每mL蟲體沉淀約達7萬枚PSC，見圖1。

2.2 自發熒光的共聚焦成像 共聚焦顯微鏡下通過藍色(DAPI通道，激發波長405 nm，檢測波長430～550 nm)、綠色(FITC通道，激發波長488 nm，檢測波長500～550 nm)、黃色(EYFP通道，激發波長514 nm、檢測波長525～600 nm)、紅色(TRITC通道、激發波長561 nm、檢測波長570～700 nm)4個通道進行拍攝，發現在相同的激發強度及探測器電壓的情況下，以405 nm激光激發的藍色熒光效果最佳，蟲體大體結構清晰，561 nm激光激發的紅色熒光效果及488 nm激光激發的綠色熒光效果其次，514 nm激光激發的黃色熒光較弱，見圖2。

(10 × object glass)

(A)可見光；(B) 405 nm激發；(C) 488 nm激發；(D)514 nm激發；(E)561 nm激發

2.3 自發熒光變化曲線的共聚焦測定 共聚焦顯微鏡下掃描分別以5種激發光激發細粒棘球蚴做自發熒光λ掃描分析繪制自發熒光曲線。①激發波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發波長633 nm，檢測波長650～750 nm。相應敏感的發射波長分別為490～520 nm、520及580 nm左右、580～600 nm、610nm～630 nm和650 nm左右，其中405 nm、488 nm和561 nm激發效果較好。514 nm、633 nm激發效果欠佳，自發熒光曲線見圖3。

(藍色)405 nm激發；(綠色)488 nm激發；(黃色)514 nm激發； (紅色)561 nm激發；(紫色)633 nm激發

2.4 自發熒光變化曲線的全波長多功能酶標儀測定 全波長多功能酶標儀以5種激發光激發細粒棘球蚴繪制自發熒光曲線。①激發波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發波長633 nm，檢測波長650～750 nm。實驗中發現全波長多功能酶標儀測定的細粒棘球蚴的自發熒光曲線其變化趨勢與共聚焦顯微鏡測定的結果基本一致，但其測定得到的熒光強度與共聚焦顯微鏡測定的結果相比很弱，見圖4。

3 討 論

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，是基礎研究中的一種很好的高靈敏度、高效的示蹤技術手段。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。然而生物體中自身具有的某些物質可在一定波長的光刺激下發出熒光，稱為自發熒光。在實際研究中，經常會發生自發熒光與所選用的熒光抗體之間出現串擾的情況，造成的假陽性及實驗結果的判讀上的困難，如果在選擇熒光抗體上合理的規避所要研究的生物體的自發熒光是每一位研究人員都需要考慮的問題。本文所得到細粒棘球蚴的蟲體自發熒光的變化規律將有助于指導囊性包蟲病基礎研究中熒光抗體的合理選擇。

生物組織自發熒光的主要物質來源有氨基酸、結構蛋白、酶和輔酶、維生素、類脂物和卟啉等，生物熒光光譜學性質是不同組織、不同結構、不同生化和物化特性等生物組織本質信息的真實反映[8]。近年來，利用生物組織的光學特性來判別組織性質和功能已成為生物醫學研究和診斷的一個重要手段[9-10]，在囊性包蟲病研究領域開展免疫學、生物醫學光子學工作對包蟲病的診斷防治研究有著積極意義，細粒棘球蚴的不同應激狀態或免疫狀態下的自發熒光有何變化規律，未來是否可能通過觀察蟲體自發熒光的變化而進行藥效學或醫學診斷學研究將是一個具有吸引力的切入點[11]。

(A) 405 nm激發；(B)488 nm激發；(C)514 nm激發；(D)561 nm激發；(E)633 nm激發；(F)陰性對照

自發熒光變化曲線是衡量生物體在受到一種激發光刺激后機體內的某些熒光物質在整個光譜中發射熒光的變化規律的一種方式。本實驗采用激光掃描共聚焦顯微鏡、全波長多功能酶標儀兩種不同儀器對細粒棘球蚴蟲體的自發熒光變化曲線進行了測定。測定結果發現，兩種測定方式所得到的蟲體的自發熒光變化趨勢基本一致，但在同樣的激發波長下，激光掃描共聚焦顯微鏡所測定的自發熒光強度要遠高于全波長多功能酶標儀。通過對兩種儀器測定原理及參數設定的比較發現，在大部分測定參數水平上，兩個儀器是沒有太大區別的，但全波長多功能酶標儀的檢測帶寬(Detection band width)只能為1 nm的范圍，而激光掃描共聚焦顯微鏡則可以自由設定并且本實驗中所設定的檢測帶寬(Detection band width)為20 nm，由于生物體的自發熒光，特別是細粒棘球蚴的自發熒光發射波長分布范圍較寬，從430 nm至650 nm都有，并且有數個主要分布范圍。由此，我們考慮細粒棘球蚴的自發熒光基本上是平均分布于每nm的光譜范圍內的，僅僅1 nm上的自發熒光強度并不高，因此，全波長多功能酶標儀在細粒棘球蚴的自發熒光強度的檢測上并不是很好的選擇，只能用作定性的熒光分析。激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到細粒棘球蚴蟲體自發熒光，其中以405 nm激發的藍色熒光最強；細粒棘球蚴蟲體自發熒光光譜較寬，主要分布于490～520 nm、610～630 nm。在應用免疫熒光技術研究細粒棘球蚴時應避免選擇綠色熒光及淺紅色熒光(如FITC、TRITC、GFP等)，以免自發熒光與所選用的熒光抗體之間出現串擾，造成實驗結果的假陽性。

綜上，本文首次描述了細粒棘球蚴體外培養條件下自發熒光及其共聚焦λ掃描特點，確定了細粒棘球蚴蟲體自發熒光在不同波長的光激發下的敏感范圍，為未來囊性包蟲病在生物醫學光子學及熒光基礎研究領域的工作奠定了基礎，同時對未來在囊性包蟲病研究中的熒光抗體的選擇具有重要的指導意義。

[1]Lin YG, Lu MK, Hong LX, et al. A review of the current status ofEchinococcusand hydatid disease, with notes on some informative achievements in China[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(6): 616-627. (in Chinese)林宇光,盧明科,洪凌仙,等.我國棘球絳蟲及棘球蚴病研究進展[J].中國人獸共患病學報,2012，28(6)：616-627.

[2]Liu XD. A study on the developmental morphology of plant cell by laser scanning confocal microscope[J]. Acta Laser Biol Sinica, 2007, 16(2): 173-178. (in Chinese) 劉向東.利用激光掃描共聚焦顯微鏡研究植物細胞發育形態學變化[J].激光生物學報,2007，16(2)：173-178.

[3]Xu ZH, Zhang ZX, Wang J, et al. Study of self-fluorescence from heart tissue[J]. Spectroscopy Spectr Anal, 2009, 29(6): 1651-1655. (in Chinese) 徐正紅，張鎮西,王晶,等.心臟組織的自體熒光研究[J].光譜學與光譜分析,2009，29(6)：1651-1655.

[4]Zhang YD, Li LS. Application of laser induced auto-fluorescence spectrum on the early diagnosis of digestive tract cancer[J]. China Med Engineer, 2006, 14(1): 40-45. (in Chinese) 張陽德, 李羅絲.激光誘導組織自體熒光光譜技術在消化道惡性腫瘤早期診斷中的應用[J].中國醫學工程,2006，14(1)：40-45.

[5]Nan MQ, Wang S, Wang KG, et al. Theoretical study on autofluorescence characteristics of skin basal cell carcinoma[J]. Acta Photonica Sinica, 2013, 42(9): 1129-1134. (in Chinese) 南妙晴,王爽,王凱歌,等.皮膚基底細胞癌癥組織熒光特性理論模擬與分析[J].光子學報,2013，42(9)：1129-1134.

[6]Huang QL, Zhang YD. Characteristics of laser-induced autofluorescence spectra in early colorectal carcinoma[J]. World Chin J Digestol, 2008, 16(6): 667-670. (in Chinese) 黃秋林,張陽德.激光誘導大鼠大腸早癌組織自體熒光光譜特征[J].世界華人消化雜志,2008，16(6)：667-670.

[7]Zou XY, Ye B, Wang JA, et al. The improved method for isolation and identification the germinal cells of Echinococcus granulosus[J]. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 2010, 32(14): 1582-1584. (in Chinese) 鄒曉毅,葉彬,王俊安,等.改進的細粒棘球蚴生發細胞分離培養方法與鑒定[J].第三軍醫大學學報,2010，32(14)：1582-1584.

[8]Xu XS, Zhang CY, Liu QM, et al. Study on the autofluorescence in fungi with laser scanning confocal microscope[J]. Acta Laser Biol Sinica, 2002, 11(2): 109-113. (in Chinese) 徐旭士,張超英,劉清梅,等.真菌的自發熒光現象研究[J].激光生物學報,2002，11(2)：109-113.

[9]Xue DM, Chen GW, Fu SG, et al. Research on histological structure of autofluorescence ofDugesiajaponica[J]. Acta Anatomica Sinica, 2009, 40(4): 642-646. (in Chinese) 薛德明,陳廣文,傅山崗,等.日本三角渦蟲自發熒光組織結構的研究[J].解剖學報,2009，40(4)：642-646.

[10]Clavel A, Varea M, Doiz O, et al. Visualization of hydatid elements: comparison of several techniques[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(5): 1561-1563.

[11]Wei L, Li BY, Du HL, et al. Study on autofluorescence and confocal λ scanning characteristics of adultSchistosomajaponicum[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(4): 322-329. (in Chinese) 魏莉,李冰燕,杜海林，等.日本血吸蟲成蟲自發熒光觀察及共聚焦λ掃描分析[J].中國人獸共患病學報,2009，25(4)：326-329.

Autofluorescence and spectrum characteristics ofEchinococcusgranulosusculturinginvitro

YANG Ning,ZHANG Xue,ZHANG Chuan-shan,LYU Guo-dong,LI Liang,LIU Huan-yuan,WANG Hui

(ClinicalMedicalResearchInstitute,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China)

The objective of this study was to illustrate the autofluorescence phenomenon and scanning confocal λ characteristics ofEchinococcusgranulosus(Eg) culturedinvitro, which can not only rich the spectroscopy and biological information ofEg, but also lay a foundation for study the immunofluorescence and medical photonics. Protoscoleces (PSC) ofEgwere aspirated and pooled from sheep liver hydatid cysts collected from a slaughterhouse. The PSC viability was determined by Methylene blue staining. The autofluorescence of endocyst were observed through the confocal microscope excited respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, and 561 nm. The autofluorescence curve was measured by thermo Varioskan Flash respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, and 633 nm. The λ scanning analysis was executed by confocal respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, and 633 nm to measure the autofluorescence curve. TheEgexcited by different excitation light through confocal showed different colors autofluorescence. Under the same excitation intensity and detector voltage condition, blue fluorescence showed the best fluorescence effect and clearer structure which excited by 405 nm laser. Scanning respectively by five different excitation lights, the corresponding sensitive emission wave lengths scope were 490-520 nm, around 520 nm and 580 nm, 580-600 nm, 610-630 nm, and around 650 nm, respectively. The 405 nm, 488 nm and 561 nm excitation effect were better than that of the 514 nm and 633 nm. The autofluorescence curve detected by Microplate Reader were basically as same as that by confocal, although the intensity detected by Microplate Reader were lower. The results indicated that the best excitation light to detect the autofluorescence ofEgis 405 nm, which showed blue fluorescence. The autofluorescence spectrum ofEgis wide, mainly in 490-520 nm and 610-630 nm. The better excitation wave lengths are 405 nm, 488 nm and 561 nm.

Echinococcusgranulosus; autofluorescence; confocal

Wang Hui, Email: wang_hui6319@sina.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.007

國家自然科學基金項目(No. 81201304) ，新疆維吾爾自治區包蟲病基礎醫學重點實驗室開放課題(XJDX0202-2013-9)聯合資助

王慧，Email: wang_hui6319@sina.com

新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院，烏魯木齊 830054

R383.3+3

A

1002-2694(2015)03-0222-05

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No. 81201304) and the Xinjiang Key Laboratory of Hydatid Fundamental Medicine (No. XJDX0202-2013-9)

2014-04-10；

2014-08-05