豬附紅細胞體ORF5 蛋白的空間結構與B細胞抗原表位預測

呂 晴，單 思，王麗君，巴彩鳳

豬附紅細胞體ORF5 蛋白的空間結構與B細胞抗原表位預測

呂 晴1，單 思2，王麗君1，巴彩鳳3

目的 預測豬附紅細胞體(Mycoplasmasuis，M.suis)ORF5 基因編碼蛋白的二級結構及其B細胞抗原表位。方法 聯合應用生物信息學軟件DNAstar與在線分析軟件IEDB的B Cell Epitope Prediction Tools預測M.suisORF5 蛋白的二級結構及其親水性區域、柔韌性區域、抗原指數、表面可及性等結構特征，經綜合分析后預測其B細胞優勢抗原表位。結果 經分析可見，M.suisORF5 蛋白具有較為規則的二級結構，潛在的優勢B 細胞抗原表位為GGVDGGRD、GMRLPEDSR、EGHPDLESAR氨基酸區段。結論 預測出M.suisORF5 蛋白二級結構和B細胞抗原表位，為M.suis免疫原性研究提供新手段，為病原微生物免疫原性研究提供新思路。

豬附紅細胞體；ORF5；二級結構；B 細胞抗原表位

豬附紅細胞體主要寄生于哺乳動物(包括人類)的紅細胞導致出血性疾病或凝血功能障礙而引起貧血性傳染病[1]。目前，世界已有三十多個國家報道了豬附紅細胞體病的感染，而我國是感染最為嚴重的國家之一，但我國對其研究較晚，直至1972年才發現和報道豬附紅細胞體病[2]。至今，豬附紅細胞體的體外培養體系尚未建立，以至于對其生物學特性與發病機制了解十分有限[3]，而關于豬附紅細胞體基因組學信息與蛋白表達研究亦較少。Hoelzle 等提出M.suis的AJ504999DNA序列，長度為1 805 bp，含有11個ORF(Open reading frame)，編碼11種假設蛋白，但并未對其進行深入研究。多處文獻報道，蛋白的二級結構及其親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性等結構特征決定與影響著B細胞抗原表位分布[4-5]。

本實驗運用生物信息學方法對M.suisORF5蛋白二級結構與生物學特性進行分析預測，將二級結構與親水性、柔韌性、抗原指數和表面可及性等參數相結合預測B細胞抗原表位，為M.suis免疫原性研究提供新手段，為病原微生物免疫原性研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 查找AJ504999基因序列及其ORF資料 登陸PubMed網站選擇Nucleotide模塊，輸入GenBank序列號AJ504999，獲得豬附紅細胞體的基因序列及M.suisORF5的資料。

1.2 蛋白二級結構預測 啟動DNAStar軟件程序中的Editseq模塊，將M.suisORF5中的氨基酸序列保存為pro格式，應用Protean模塊分析和預測M.suisORF5蛋白的二級結構及其生物學特性。應用Gamier-Robson法和Chou-Fasman法分別分析預測M.suisORF5蛋白的二級結構，應用Kyte-Doolittle法預測其親水性區域，Karplus-Schulz法預測其柔韌性區段，Jameson-Wolf法預測其抗原指數，Emini法預測表面可及性。登陸IEDB的B Cell Epitope Prediction Tools,應用Kolaskar-tongaonkar法預測平均抗原指數。

1.3 抗原表位的預測 綜合考慮空間結構、親水性、柔韌性、抗原指數和表面可及性等參數，進行分析和預測M.suisORF5編碼蛋白的潛在優勢B細胞抗原表位。

2 結 果

2.1M.suis的AJ504999-ORF5氨基酸序列 MCPNFRGGVDGGRDGFRLGILRTRFQGCLASNLCPGCPCCLTAGWRCEEMRLPEDSRPPCTLQGLSEYPLMLGFRTSVLSYCSGNFRWTRRRVLRGRGSGEGHPDLESARSGTWTQRGWARTSM。其含有124個氨基酸，相對分子量為13 836.92，等電點為9.02。

2.2M.suisORF5蛋白質二級結構預測 Protean模塊運用Gamier-Robson法和Chou-Fasma法預測M.suis ORF5蛋白的二級結構發現，兩者預測的結果顯示，β-折疊和β-轉角區域的重合率相對較高。Gamier-Robson法預測不存在α-螺旋，存在較多的β-折疊和β-轉角，偶見單個氨基酸出現，其β-折疊最大的一個區段是60-80氨基酸，β-轉角最大區段是27-36，無規則卷曲分布區段較分散，而Chou-Fasman法預測α-螺旋分布45-52、69-72區域。β-折疊分布區段均較長，最大區段是70-81，β-轉角區域較分散，最大區段是30-37。Gamier-Robson法預測的無規則卷曲分布區段分散。見圖1、表1。

A：α-螺旋；B：β-折疊；T：β-轉角區域；C：無規則卷曲區域

表1 Gamier-Robson 法與Chou-Fasman 法預ORF5蛋白的二級結構

2.3M.suis ORF5蛋白結構特征

2.3.1 親水性分析 Protean模塊運用Kyte-Doolittle 法分析ORF5蛋白的親水性發現，其親水區段分布較多，主要分布于2-16,23-28,45-67,83-124氨基酸，見圖2。

圖2 Kyte-Doolittle 法分析ORF5蛋白的親水性

2.3.2 柔韌性分析 Protean模塊運用Karplus-Schulz法預測蛋白骨架區的柔韌性，柔韌性區段主要分布于5-16,23-25,53-60,64-66,76-77,84,90-92,94-119,121氨基酸，見圖3。

2.3.3 抗原指數分析 Protean模塊運用Jameson-Wolf方案預測的抗原指數可見，ORF5蛋白抗原指數較高的區段較多，主要位于7-15,50-60,93-113,118-121，見圖4。在線分析軟件IEDB運用Kolaskar-Tongaonkar 法預測ORF5蛋白抗原表位指數，平均抗原指數為1.015，見圖5。

圖3 Karplus-Schulz 法預測ORF5蛋白的柔韌性區段

圖4 ORF5編碼的蛋白的抗原指數分析

圖5 ORF5結構蛋白的抗原表位指數分析

圖6 ORF5蛋白的表面可及性分析

2.3.4 表面可及性分析 Protean模塊運用Emini法預測表面可及性可見，其氨基酸位于蛋白質分子表面可能性較大的區段位于1-2,12,22,27-32,44-45,57-61,故這些很有可能位于蛋白質的表面的區段可能成為優勢表位，為構建表位疫苗提供靶點。見圖6。

2.4 B細胞抗原表位預測 結合ORF5蛋白的二級結構及結構特征等參數分析，若表面可及性指數≥1，親水性指數≥0，抗原指數≥1.015，表面可及性指數≥1，且其內部或附近又具有柔韌性結構，區段氨基酸個數≥7，則這一區段成為抗原表位的可能性較大，經過篩選有3個區段可作為B細胞優勢抗原表位，見表2。

表2 ORF5 編碼蛋白B 細胞抗原表位的氨基酸序列

3 討 論

B細胞抗原表位是由肽鏈上順序連續的氨基酸組成，對其深入研究有益于推進免疫識別基礎理論和實際應用，對疾病的診斷、定點改造蛋白分子降低蛋白藥物免疫原性，設計無毒副作用的人工疫苗以及免疫干預治療等有重要意義[6]。學者們指出，蛋白的空間結構決定了蛋白的功能與B細胞抗原表位的分布。在蛋白二級結構中，β-轉角結構為凸出結構，多位于蛋白抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位，而α-螺旋、β-折疊結構規則穩定不易變形，較難嵌和抗體，成為B細胞抗原表位的幾率極小。換言之，B細胞抗原表位多位于蛋白外側，故而位于蛋白的外側親水氨基酸殘基區段與表面可及性指數高的區段作為抗原表位的幾率較高[7]。另外，柔韌性與抗原指數等結構特征也決定了B細胞抗原表位的分布。柔韌性區段具有較強的可塑性，易于抗體嵌入。抗原指數高的區段免疫原性強，成為抗原表位的幾率大。迄今，對于B細胞抗原表位的預測，學者們提出了各自不同的分析方法,目前多采用綜合分析法，權重選擇蛋白的空間結構、親水性、柔韌性、表面可及性、抗原指數等結構參數進行預測[8-11]。由于軟件分析存在一定的局限性，故將多種方法和多參數分析的結果進行綜合，這樣可提高預測的準確性和可信性[12]。

目前,M.suis蛋白的結構還未成功解析, 其相應的二級結構也未知。本研究聯合采用生物信息學軟件DNAstar與IDEB的B Cell Epitope Prediction Tools綜合分析M.suisORF5編碼的蛋白，研究結果顯示，M.suisORF5編碼的蛋白的氨基端β-轉角區段和無規則卷曲分布區段較多，相應區域相的親水性、柔韌性、抗原指數和表面可及性等參數也較高，故而預測此區段為潛在優勢B細胞抗原表位所在區段。該預測結果為M.suis免疫原性研究提供新手段，為病原微生物免疫原性研究提供新思路。

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Prediction of the secondary structure and B-cell epitopes ofMycoplasmasuisORF5 protein

LYU Qing1,SHAN Si2,WANG Li-jun1,BA Cai-feng3

(1.DepartmentofPediatrics,LiaoheOilfieldGeneralHospital,Panjin121000,China; 2.ResearchCenterforDifferentionandDevelopmentofTCMBasicTheory,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China; 3.CenterofLaboratoryAnimals,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121000,China)

The objective of the study is to predict the spatial structure and B-cell epitopes ofMycoplasmasuisORF5 protein. The secondary structure, hydrophilicity, flexible region, antigenic index and surface probability were analyzed and predicted by the Protean module in DNAStar software and B Cell Epitope Prediction Tools of IDEB, then B-cell epitopes were predicted by aggregate analysis. Results showed that the secondary structure ofMycoplasmasuisORF5 protein was relatively regular, in which the potential B cell antigenic epitopes were located at GGVDGGRD, GMRLPEDSR, and EGHPDLESAR. The methods of prediction of the secondary structure and B-cell epitopes ofMycoplasmasuisORF5 protein may provide a new method for the study ofM.suisimmunogenicity, and provides a new idea for the study on immunogenicity of pathogenic microorganisms.

Mycoplasmasuis; ORF5; Secondary structure; B-cell epitopes

Ba Cai-feng,Email:bacaifeng@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.014

遼寧省科技基金資助項目(No.2006408002-6)

巴彩鳳，Email：bacaifeng@163.com

1.遼河油田總醫院，盤錦 124010; 2.江西中醫藥大學，中醫基礎理論分化發展研究中心，南昌 330004; 3遼寧醫學院，實驗動物中心，錦州 121000

R518.1；R392.12

A

1002-2694(2015)03-0251-04

Supported by the Liaoning province Science and Technololgy Fund Project(No.2006408002-6)

2014-04-02；

2014-10-28