采用熒光猝滅法研究穗花杉雙黃酮與牛血清白蛋白的相互作用

陳科力，趙 平

(湖北中醫藥大學 教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室，武漢 430065)

采用熒光猝滅法研究穗花杉雙黃酮與牛血清白蛋白的相互作用

陳科力，趙 平

(湖北中醫藥大學 教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室，武漢 430065)

目的:運用熒光猝滅法研究不同溫度下穗花杉雙黃酮(AMF)與牛血清白蛋白 (BSA)的相互作用. 方法:采用熒光光譜研究AMF與BSA之間的猝滅類型，計算二者之間的結合常數及結合位點數等. 結果:穗花衫雙黃酮能使BSA發生內源性熒光猝滅，屬靜態猝滅機制.在298,308,318 K下,AMF與BSA結合常數分別為6.73, 6.38, 6.17 L·mol-1, 結合位點數n近似為1; 熱力學分析表明AMF與BSA之間結合力為靜電力作用; 同步熒光光譜表明AMF使BSA構象發生改變，且色氨酸所處微環境的疏水性增強. 結論: 熒光猝滅法可用于AMF與BSA之間結合反應的研究，方法簡便，靈敏度高.

穗花杉雙黃酮；牛血清白蛋白；熒光猝滅

血清蛋白是血清中含量最豐富的蛋白質，它能與許多內源及外源性化合物結合，起到存儲和轉運作用，是藥物發揮藥效的重要載體和靶分子. 藥物在體內的吸收分布、代謝及排泄等過程，直接影響到藥物在其作用部位的濃度和有效濃度的持續時間，從而決定藥物藥理作用和毒性作用的發生、發展和消除. 而影響藥物在體內分布的因素很多，其中藥物與血清白蛋白的結合率是決定藥物在體內分布的重要因素，因此，研究藥物與血清蛋白相互作用在藥理學、藥效學、生物化學等方面都有重要作用[1].

穗花杉雙黃酮(AMF)是中藥卷柏的主要活性成分之一，它是一種雙黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤[2]、降血糖和擴張血管等多種生物活性,目前對其與血清白蛋白相互作用的的研究尚不多見[3，4].

熒光光譜法因其儀器常見、方法簡單、操作方便、靈敏度高且樣品用量小等優點，而成為研究生物大分子特別是蛋白質與各種小分子相互作用的重要手段[5-10]. 本實驗采用熒光猝滅法研究了AMF與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，得到了二者之間反應的猝滅常數、結合常數、結合位點數等，根據熱力學參數探討了它們之間的作用力類型，為進一步闡明在AMF人體內的儲存方式、傳輸機制及藥理作用等提供了重要信息.

1 儀器與試劑

F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司),HB-1000 型雜交爐(基因有限公司).

磷酸鹽緩沖液(PBS,上海捷瑞生物工程有限公司), BSA(上海捷瑞生物工程有限公司)用水配置成濃度為2.00×10-5mol·L-1的溶液, AMF(中國食品藥品檢定研究所)用乙醇配置成濃度為5.00×10-5mol·L-1的溶液, 實驗用水為二次蒸餾水, 乙醇等其他試劑均為分析純, 上述溶液均置于1～4 ℃冰箱中保存.

2 試驗方法

在8支試管中分別加入1.0 mL的PBS緩沖溶液，200 μL BSA溶液，再分別加入0，20，30，40，50，60，70 μL的濃度為5.00×10-5mol·L-1穗花杉雙黃酮溶液，然后分別用水稀釋至2.0 mL，混合均勻后，在一定溫度下恒溫反應30 min.以激發波長為280 nm，激發和發射狹縫為5 nm條件下，掃描300～450 nm范圍內的熒光發射光譜.

3 結果與討論

3.1 AMF對BSA的熒光猝滅光譜

固定BSA的量，改變AMF在體系中的濃度，圖1是不同濃度的AMF存在條件下體系的熒光發射光譜，如圖所示，BSA在338 nm處有最大吸收峰，隨著AMF濃度的增加，BSA熒光逐漸被猝滅，表明AMF與BSA發生較強的相互作用.

(a) 2.00×10-6L mol·L-1 BSA； (b) to (g): 2.00×10-6L mol·L-1 BSA in the presence of 5.00×10-7,7.50×10-7,1.00×10-6,1.25×10-6,1.50×10-6,1.75×10-6 mol·L-1 AMF, respectively圖1 熒光發射光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectra

引起蛋白熒光猝滅的原因有動態和靜態猝滅兩種.動態猝滅是一種電子或能量轉移過程，是猝滅劑與熒光物質在激發態的相互作用，其擴散系數與雙分子猝滅常數隨溫度的升高而增大.靜態猝滅過程一般在基態生成不發熒光的復合物，且復合物的穩定性與靜態猝滅常數隨溫度的增加而減小[11]. 動態猝滅過程符合Stern-Volmer方程[12]：

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q].

(1)

F0,F分別為加入BSA前后的熒光強度，Ksv為猝滅速率常數，Kq為雙分子猝滅反應速率常數，τ0為猝滅劑不存在時生物大分子的平均壽命，約為10-8s[13],[Q]為猝滅劑AMF.先假定該反應過程為動態猝滅，根據Stern-Volmer方程，F0/F與藥物的濃度[Q]呈線性關系，由F0/F對[Q]作圖,所得直線的斜率即為Ksv(如圖2).

分別測定298,308,318 K條件下的AMF對BSA的熒光猝滅影響，結果表明猝滅常數隨著溫度的增加而減小(見表1)，且求得的猝滅速率常數Kq遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數2.00×1010L·moL-1·s-1,不符合動態猝滅規律，由此可推斷，AMF對BSA的猝滅過程屬于靜態猝滅.

圖2 不同溫度下穗花衫雙黃酮對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線Fig.2 Stern-Volmer of fluorescence of BSA quenching by AMF at different temperatures(λex=280 nm, λem=338nm,pH=7.4 )

T/KKsv/(L·mol-1)Kq/(L·mol-1)R2988.9×1058.1×10130.98843088.1×1058.9×10130.99373187.2×1058.1×10130.9952

3.2 結合常數、結合位點的確定

對于靜態猝滅，結合常數、熒光強度與猝滅劑濃度之間的關系可用下式[14]表示:

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q].

利用lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖可得線性關系，如圖3所示，根據線性擬合的斜率和截距可算出結合常數KA和結合位點數n(見表2).從表2可以看出AMF與BSA的結合常數較大,隨溫度升高而降低,即所形成的復合物穩定性降低[15],但溫度對結合位點數n的影響較小,n約為1.

圖3 BSA與AMF相互作用位點結合模型圖Fig.3 The binding sites number of BSA-AMF at 298, 308,318 K, respectively

T/KKA(L·mol-1)nR2986.731.130.97033086.381.080.99483186.171.050.9932

3.3 AMF與BSA之間作用力類型的確定

有機小分子與生物大分子之間的結合作用力包括氫鍵作用、范德華力、靜電作用、疏水作用力[16].當溫度變化不大時反應的焓變ΔH可以看作一個常數.根據公式Van′t Hoff方程[17]：

lnK=ΔS/R-ΔH/TR.

其中K為猝滅常數，T為溫度(298,308,318 K),以lnK對1000/T作圖得到直線(如圖4)，通過直線截距和斜率求得ΔS和ΔH(見表3). 不同溫度下吉布斯自由能ΔG由下式計算：

ΔG=ΔH-TΔS.

圖4 Van′t Hoff 曲線Fig.4 Van′t Hoff plot

根據反應前后熱力學焓變ΔH、熵變ΔS的相對大小可判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型[18]. 從表3可以看出ΔG<0,說明反應是自發進行的；ΔH<0，ΔS>0,根據Ross和Subramanian[18]兩位學者判斷小分子與生物大分子作用力類型的規律，AMF與BSA形成復合物的作用力主要為靜電力.

表3 AMF與BSA相互作用的熱力學參數

3.4 AMF對BSA構象的影響

同步熒光光譜可以反映藥物分子對蛋白質構象變化的影響.由Δλ=15 nm和Δλ=60 nm所得同步熒光光譜分別顯示酪氨酸(Tyr)殘基和色氨酸(Trp)殘基的光譜特征[19-21]. 因芳香氨酸殘基的最大發射波長與其所處環境的極性有關，根據最大熒光發射波長的變化可判斷殘基所處微環境的變化[22]. 如圖5中(a)、(b)分別為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時AMF與BSA作用的同步熒光光譜. 圖中顯示，在BSA濃度一定時，隨著AMF濃度的增加，BSA的熒光強度被猝滅，酪氨酸的最大發射峰基本保持不變，而色氨酸的最大發射峰略微藍移，表明AMF的加入使BSA的構象發生改變[23]. 在反應過程中酪氨酸殘基所處微環境基本沒有變化，而色氨酸所處微環境的疏水性增強，親水性下降，表明AMF與BSA的結合位點更接近色氨酸殘基.

CBSA=2.00×10-6 mol·L-1 , from 1 to 9 the CAMF : 0, 0.25×10-6, 0.50×10-6, 0.75×10-6, 1.00×10-6, 1.25×10-6, 1.50×10-6, 1.75×10-6, 2.00×10-6mol·L-1 respectively. (a) Δλ=15 nm, (b) Δλ=60 nm圖5 AMF與BSA作用的同步熒光光譜圖Fig.5 The synchronous fluorescence spectra of BSA in the present of AMF (T=298 K, pH=7.4)

4 結論

經實驗及理論計算表明，AMF對BSA的熒光猝滅機理為靜態猝滅，與BSA相互作用時具有一個結合位點，且它們反應為自發過程.由于二者的結合常數較大，易與白蛋白結合形成復合物，因此能夠明顯影響AMF在血漿內的游離藥物濃度，從而影響其在體內的轉運過程及藥物代謝、藥理作用等，因此研究AMF與白蛋白的相互作用對指導臨床用藥具有重要意義.

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Study on the Interaction between Amentoflavone and Bovine Serum Albumin by Fluorescence Quenching Method

ChenKeli,ZhaoPing

(Key Laboratory of Education Department on Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)

Objective: To study the mechanism of interaction between Amentoflavone (AMF) and Bovine Serum Albumin (BSA) at different temperatures by fluorescence quenching method. Method: The quenching type, binding constant and binding site was investigated by fluorescence spectrometry. Result: AMF could induce an endogenous fluorescence quenching of BSA under a mechanism of static quenching. The binding constants were detected to be 6.73(298 K), 6.38(308 K), 6.17(318 K) L·mol-1and the binding site (n) was about 1, respectively. The thermodynamic parameters suggested that the interaction force between AMF and BSA was electrostatic force. The results of synchronous fluorescence spectra showed AMF can change the conformation of BSA, the hydrophobicity around the tryptophan residues was increased. Conclusion: Fluorescence quenching method could be applied to study the interaction between AMF and BSA. It is a convenient and delicate method.

Amentoflavone; bovine serum albumin; fluorescence quenching

2015-06-30

陳科力(1947-)，男，教授，博導，研究方向中藥資源及其品質研究,E-mail:kelichen@126.com

國家科技重大專項“中藥新藥安全性檢測技術與標準研究”子課題(2014ZX09304307-001-021)

O657.3

A

1672-4321(2015)03-0045-05