香蕉MaTPS1基因序列及其表達特性分析

許桂鶯，徐碧玉，邢文婷，賈彩虹，王 卓，常勝和，王安邦，舒海燕，金志強，*

（1中國熱帶農業科學院海口實驗站，海口570102；2華中農業大學，武漢430070；3中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術研究所，海口571101；4海南省林業科學研究所，海口571100）

香蕉MaTPS1基因序列及其表達特性分析

許桂鶯1，2，徐碧玉3，邢文婷4，賈彩虹3，王 卓3，常勝和1，王安邦1，舒海燕1，金志強1，3*

（1中國熱帶農業科學院海口實驗站，海口570102；2華中農業大學，武漢430070；3中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術研究所，海口571101；4海南省林業科學研究所，海口571100）

通過隨機克隆測序法，從香蕉根系cDNA文庫中獲得海藻糖合成酶基因，命名為Ma TPS1。Ma TPS1擴增獲得cDNA序列，全長3 946 bp，開放閱讀框2 562 bp，編碼853個氨基酸。生物學信息分析表明，Ma TPS1蛋白屬于不穩定蛋白，等電點4.72，具有TPS和TPP結構域。序列預測分析表明，Ma TPS1蛋白定位于細胞質中，不存在信號肽，為跨膜疏水蛋白。與已知植物TPS氨基酸同源序列比對結果顯示，一致性達74.81%，其中與2種馬來西亞野生蕉、玉米、野茶樹、中果咖啡的TPS編碼氨基酸序列一致性分別為100%、79.91%、71.33%、63.93%和65.13%。器官特異性分析表明，Ma TPS1在香蕉的根、球莖、假莖、葉、花和果實中都有表達，其中在根、球莖、假莖和花中表達量較高。qRT-PCR分析表明，ABA、ACC、干旱、低溫、鹽害和枯萎病脅迫處理后，Ma TPS1表達量在鹽脅下增加，于24 h時達到最高，而在其他脅迫下較正常條件下降低。研究認為，Ma TPS1可能參與調控香蕉抗鹽脅迫機制，從而提高香蕉耐鹽性。

香蕉；海藻糖-6-磷酸合成酶基因（TPS1）；生物信息學；表達分析

海藻糖是由2個葡萄糖分子通過a-1，1糖苷鍵結合而形成的非還原性二糖，為白色結晶，帶有2個結晶水，分子式為C12H22O11·2 H2O［1］。廣泛存在于植物、真菌、細菌和無脊椎動物體內，于1882年首次被Wiggers在黑麥的麥角菌中分離出來。具有生物抗逆性，無毒性，不能被糖苷酶水解，在高溫、干旱、高鹽、冷凍和氧化脅迫等條件下保護蛋白質、生物膜等生物大分子物質或細胞膜，被認為是生物體抵御脅迫環境的應激代謝物［2-3］。有研究表明，海藻糖能夠阻止細胞磷脂雙分子膜由液晶態向固態轉變，穩定蛋白質，從而增強植物細胞在非生物脅迫下的抗逆性，而在自然界中，這種極穩定的理化性質在葡萄糖、麥芽糖等雙糖中是沒有的［4］。近年來有關海藻糖的理化性質、作用機理、代謝途徑等均得到較為深入的研究，而分子生物學領域的研究也逐漸興起。已有許多學者在作物育種方面、海藻糖合成基因等都有研究。胡慧芳［5］通過將外源海藻糖施加于經PEG6000、180 mmol·L—1的NaCl、4℃低溫等非生物脅迫處理黃瓜幼苗，發現經外源海藻糖處理過的幼苗，葉片中相對含水量、葉綠素含量升高，電導率和MDA含量降低，POD、SOD和CAT活性提高，說明海藻糖可緩解干旱對黃瓜幼苗生長的脅迫，減輕高鹽、低溫對幼苗的傷害。喬利仙［6］利用分子標記（SRAP、TRAP、RSAP）對16個紫菜系進行遺傳多樣性分析，獲得Py TPS克隆、測序后通過轉基因技術導入水稻體內，獲得的轉Py TPS水稻的抗旱、抗鹽性明顯增強。關于在非生物脅迫條件下，海藻糖增強植物抗逆性的研究報道已屢見不鮮［7-8］。目前，國內外僅有1篇文獻報道有關香蕉海藻糖合成酶基因在生物脅迫下的功能研究［9］，關于海藻糖合成酶基因在非生物脅迫下的功能研究未見報道。

香蕉是一種多年生芭蕉屬草本單子葉植物，屬于食用水果，廣義上的香蕉包括香蕉（banana）和大蕉（plantain），是高溫多濕特性的熱帶地區人們的主要糧食作物，也是重要的經濟收入來源。由于土地干旱，以及農藥、肥料的不恰當使用，使土地鹽堿化日趨嚴重，香蕉產量遭受著不同程度的影響。為豐富香蕉抗逆基因資源，本實驗以香蕉苗為材料，對香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因（Ma TPS1）進行初步的生物信息學分析，通過q RT-PCR分析Ma TPS1在不同脅迫下的表達，以期為進一步探討Ma TPS1是否參與香蕉抗逆機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

香蕉苗源自中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所澄邁香蕉種植園。取正常條件下生長的五葉一心香蕉幼苗（Musa acuminata L.AAA group cv. brazilian）的根、球莖、假莖、葉片，以及該品種成年香蕉樹的花和果實，用清水清洗不同香蕉組織器官后立即用液氮速凍，于—70℃保存備用。

1.2 蛋白質同源序列比對及系統發生分析

從香蕉果實抑制縮減雜交文庫中獲得海藻糖合成酶基因片段，通過RACE技術獲取其c NDA全長序列，將全長序列在NCBI ORF Finder查找開放閱讀框ORF，利用Prot Param（http：//web.expasy. org/protparam）在線分析其理化性質，PSORT Prediction軟件預測亞細胞定位情況，SignalP 4.1 Server，TMpred軟件分析蛋白信號肽和跨膜結構，NCBI Conserved Domain軟件推導Ma TPS1氨基酸序列保守結構域。

在NCBI數據庫Blastx中查找同源序列，利用DNAMAN軟件進行同源序列比對，通過MEGA 5.0軟件分析Ma TPS1蛋白與其他植物TPS蛋白序列的進化關系，構建分子進化樹。

1.3 MaTPS1在不同器官特異性表達分析

取正常條件下生長的五葉一心香蕉幼苗的根、球莖、假莖、葉片以及該品種成年香蕉樹的花和果實的DNA為模板，采用半定量方法對其進行組織特異表達分析。以Ma Actin1引物Pf（CGAGGCTCAATCAAAGA）和Pr（ACCAGCAAGGTCCAAAC）為內參引物，Ma TPS1引物為Pf 1（ATGGGAATCATTCATGCTAG）和Pr1（ACCACGCCTTTGCTTATC）。在熒光定量PCR儀上進行，反應程序為95℃預變性30 s，95℃變性7 s，56℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環后做熔解曲線（95～55℃，0.1℃·s—1），反應體系為25μL。在Tonan凝膠成像系統儀上獲取cDNA擴增條帶的電泳圖片，比較不同香蕉組織器官中Ma TPS1表達量濃度。

1.4 Ma TPS1在不同脅迫下的表達特性分析

1.4.1 總RNA提取和cDNA合成 采用本實驗室前期改良的CTAB方法提取以上脅迫處理的香蕉根系總RNA。利用M-MLV反轉錄酶（Ta KaRa公司）合成第一條鏈c DNA鏈，具體操作過程詳見試劑盒說明書。以已合成的cDNA為模板進行實時定量PCR分析。

1.4.2 高鹽和干旱脅迫處理 取40株生長健壯的五葉一心香蕉幼苗，分為2組，每組3個處理，每個處理5株，以0 h處理為對照。利用土壤水分測試儀測定每盆幼苗培養基質水分，并保持80%水分含量。將香蕉幼苗連帶基質分別浸泡于200 mmol/L NaCl和200 mmol/L PEG6000溶液中，浸沒根部，脅迫處理時間分別為6、12和24 h。用無菌水洗凈根部，取樣，液氮速凍，放置—80℃保存，提取RNA［10］。

1.4.3 不同外源激素處理 取60株生長健壯的五葉一心香蕉幼苗，分為3組，每組20株，將幼苗連帶培養基質分別浸泡于濃度均為100μmol/L ACC和ABA 2種水溶液中，浸沒過幼苗根部。處理0、6、12和24 h后，用無菌水洗凈根部基質，取樣，液氮速凍，放置—80℃保存，提取RNA［10］。

1.4.4 枯萎病4號小種浸染香蕉苗根系 取20株生長健壯的五葉一心香蕉幼苗，分為3組，每組20株。在正常管理條件下，將枯萎病4號小種（Foc TR4）真菌體澆灌幼苗培養基質，致使菌絲體侵害幼苗根部，處理0、1、2和3 d之后洗凈根部基質，取樣，液氮速凍，放置—80℃保存，提取RNA［10］。

圖1 MaTPS1氨基酸序列的保守結構域分析Fig.1 Analysis of MaTPS1 amino acid conservative structure domain

2 結果與分析

2.1 Ma TPS1全長cDNA獲得及序列分析

通過隨機克隆測序的方法從香蕉根系cDNA文庫中獲得海藻糖合成酶基因，命名為Ma TPS1。通過擴增獲得的Ma TPS1 cDNA序列全長為3 946 bp。根據NCBI ORF Finder和GENACAN軟件分析表明，Ma TPS1全長cDNA包含95 bp 5'端非編碼區、349 bp 3'端非編碼區和2 562 bp開放閱讀框。在同一編碼框內含有1個翻譯起始密碼子為TAG和1個終止密碼子TGA，表明此序列是1個全長基因，其ORF編碼853個氨基酸。

ProtParam在線分析理化性質，推測Ma TPS1蛋白的分子式C11915H19886N3946O4961S1055，相對分子量為331 621.7 Da，等電點4.72，不穩定參數45.49，屬于不穩定蛋白。其理論半衰期為7.2 h，親水性平均數0.850；通過Protscale分析預測該蛋白為疏水性蛋白，脂肪指數為23.82。分別由23.8%Ala、26.7%Cys、23.7%Gly、25.7%Thr等4種氨基酸組成。

PSORT Prediction軟件預測MaTPS1蛋白亞細胞定位最大可能性是在細胞質中。SignalP 4.1 Server軟件分析發現，Ma TPS1蛋白不存在信號肽。TMpred軟件分析蛋白跨膜結構，預測Ma TPS1蛋白存在3個跨膜結構域，分別位于第147～173，第469～485，第549～567個氨基酸殘基，屬于跨膜蛋白。NCBI Conserved Domain軟件推測Ma TPS1蛋白包含GT1-TPS、Trehalase-PPase（TPP）2種氨基酸序列保守結構域，分別屬于Glycosyl transferase-GTB類超級家族和HAD-like超級家族；此外，還有一個PLN02205（UDP-forming）多結構域（圖1）。

2.2 MaTPS1蛋白的同源序列比對和系統進化分析

利用DNAMAN將Ma TPS1 ORF cDNA推導的氨基酸序列與NCBI數據庫中已登錄的其他高等植物TPS氨基酸序列進行同源性比較，結果顯示：Ma TPS1編碼的氨基酸序列與其他植物TPS氨基酸序列的同源性較高，一致性達74.81%。香蕉Ma TPS1氨基酸序列與2種馬來西亞野生蕉（Musa acuminata subsp.malaccensis）、玉米（Zea mays）、野茶樹（Camelliasinensis）、中果咖啡（Coffeaca-nephora）、銀杏（Ginkgo biloba）、蓖麻（Ricinus communis）和可可（Theobroma cacao）的氨基酸序列一致性分別為100%、79.91%、71.33%、63.93%、65.13%、63.15%、61.23%和60.39%，說明植物TPS蛋白具有高度保守性（圖2）。

圖2 Ma TPS1編碼的氨基酸序列與其他植物TPS蛋白序列的同源性分析由上而下依次為：蓖麻TPS（XP_002511428.1）、可可TPS（XP_007036166.1）、木本棉TPS（ACI62866.1）、銀杏TPS（AAX16014.1）、野茶樹TPS（AGD98700.1）、中果咖啡TPS（CDP02920.1）、馬來西亞野生蕉TPS1（XP_009390520.1）、香蕉Ma TPS1、馬來西亞野生蕉TPS2（XP_009409766.1）、玉米TPS（AFW73825.1）Fig.2 The homology analysis of MaTPS1 amino acid with other plant TPS The order is Ricinus communis TPS（XP_002511428.1），Theobroma cacao TPS（XP_007036166.1），Gossypium arboretum TPS（ACI62866.1），Ginkgo biloba TPS（AAX16014.1），Camellia sinensis TPS（AGD98700.1），Coffea canephora TPS（CDP02920.1），Musa acuminata subsp.malaccensis TPS 1（XP_009390520.1），Musa acuminata TPS1，Musa acuminata subsp.malaccensis TPS2（XP_009409766.1），Zea mays TPS（AFW73825.1），respectively.

通過與其他植物TPS蛋白序列構建系統進化樹，分析發現MaTPS1蛋白與馬來西亞野生蕉聚為一類，說明二者的親緣關系較近，此外與玉米、野茶樹的進化關系也近（圖3）。

2.3 MaTPS1在香蕉不同器官中的表達分析

Ma TPS1在香蕉植株的根、球莖、假莖、葉、花、果實各器官中均有表達，其中在根、球莖、假莖和花中表達量較大且差異不明顯，在葉片及果實中表達量較少（圖4），表明Ma TPS1在香蕉不同部位表達水平具有組織差異性。推測Ma TPS1在植株不同器官的生理過程中起著一定的作用，并且與香蕉植株抗逆密切相關。

圖3 不同植物中TPS氨基酸序列的進化樹分析標尺表示不同植物每個TPS氨基酸序列之間的差異為0.05，分支上的數值表示通過自展法重復1 000次排列后分支的可信度Fig.3 Phylogenetic analysis of TPS amino acid in various plants The scale represented the difference of every TPS amino acid from different plants was 0.05，The number on the branches represented the credibility of the branch after repeated 1 000 times to arrange

圖4 Ma TPS1在香蕉不同器官中的表達分析Fig.4 Analysis of Ma TPS1 expressed in different organs from banana

2.4 MaTPS1在不同脅迫處理下的特異表達分析

實驗所采用處理包括：非生物脅迫（100μmol/L ABA、100μmol/L ACC、8℃、200 mmol/L PEG-6000、200 mmol/L NaCl）和生物脅迫（Foc TR4）處理。提取上述經非生物脅迫和生物脅迫處理后香蕉根系總RNA，通過qRT-PCR分析根系中Ma TPS1的表達量。如圖5所示，隨著ABA、ACC、低溫、干旱和高鹽5種非生物脅迫處理時間的增加，根系Ma TPS1表達量在高鹽脅迫下顯著增加，并在24 h時達到極顯著水平，為0 h時的2.7倍；其表達量在低溫和干旱脅迫下低于0 h；ACC處理下，12 h時Ma TPS1表達量增加，其他處理時間其表達量低于0 h；ABA處理下，Ma TPS1表達量也低于0 h。另外，在接種Foc TR4后，Ma TPS1在根系中的表達量顯著低于0 h的表達量（圖6）。以上結果表明，Ma TPS1可能參與調控香蕉抗鹽脅迫機制，從而提高香蕉耐鹽性；Ma TPS1不參與調控香蕉生物脅迫的抗逆機制。

圖5 Ma TPS1在不同非生物脅迫下的根部表達量分析Fig.5 Expression of Ma TPS1 in roots under different abiotic stresses

3 討 論

海藻糖是一種滲透調節物質，由UDP-葡萄糖和6-磷酸-葡萄糖在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的作用下生成6-磷酸-海藻糖，再經海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphatephosphatase，TPP）的脫磷酸作用生成海藻糖［11-12］，但植物細胞內廣泛存在非特異磷酸酯酶，可以不經過TPP直接催化6-磷酸海藻糖脫磷酸化轉化為海藻糖，可見TPS蛋白是海藻糖合成過程的一個關鍵酶，而編碼TPS蛋白的TPS轉錄表達對于植物體內海藻糖的合成具有決定性作用［13］。

蔣偉［14］經克隆玉米Zm TPS家族研究分析，Zm TPS基因具有TPS和TPP兩個結構域，N端為TPS結構域，C端為TPP結構域；并通過酵母突變體互補實驗證明Zm TPS家族基因中Zm TPS3具有TPS催化活性和具有TPP催化活性，參與調控海藻糖合成。丁菲等［15］研究報道指出，編碼932個氨基酸的茶樹Cs TPS（GenBank登錄號JQ742017）具有明顯的2個結構域TPS和TPP，在茶樹體內可能參與抗寒機制。本實驗Ma TPS1編碼853個氨基酸，具有TPS和TPP結構域，作用于底物UDP-葡萄糖和6-磷酸-葡萄糖，調控海藻糖的生物合成。經TMpred軟件預測，Ma TPS1定位于細胞質中的可能性較大，所編碼蛋白為跨膜性疏水蛋白。

圖6 Ma TPS1在Foc4病菌脅迫下根部的表達模式Fig.6 Expression of Ma TPS1 in roots treated by Fusarium oxysporum Schl

本實驗中，Ma TPS1在香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實中都有表達，其中在根、球莖、假莖及花中的表達豐度較大。丁菲等［15］研究表明CsTPS在茶樹不同器官中表達量依次為花＞根＞莖＞芽＞葉＞種子，并指出器官差異表達可能是由不同組織和器官發育分化情況、空間位置、代謝活動、功能及環境條件等造成。因此，推測Ma TPS1的表達在香蕉不同器官中可能具有組織差異性。

海藻糖廣泛存在于細菌、無脊椎動物、高等植物等不同生物體中，在植物體內存在很少，既是糖源也是防御植物組織因處于惡劣環境中而影響其生長發育和產量的糖類物質。研究發現，海藻糖與其他糖（甘露糖、葡萄糖等）擁有較多羥基，能夠與膜磷脂頭部發生氫鍵結合，替代水分子，維持生物膜結構，這就是“水替代假說”［16］。所以在高鹽、高溫、冷凍、干旱等不利環境下，海藻糖能夠起到保護、穩定蛋白質和細胞膜的作用。

KOSMAS等［17］研究表明，栽培棉Gb TPS參與海藻糖生物合成和脅迫信號轉導。JAE等［18］番茄轉具有雙官能團的酵母TPS基因實驗表明，轉基因葉片內海藻糖濃度的增加提高了植株的耐旱和耐鹽性，光合速率也較野生植株強。TAREK［19］通過高效液相色譜法測定3種不同小麥植株在干旱、鹽脅迫下海藻糖的含量，研究表明在Bolal小麥根系和葉片中有海藻糖存在，同時含量增加，其中小麥根部海藻糖含量最高，并且TPS蛋白酶活性為正常條件下的3～4倍。王三根等［20］將經海藻糖預處理的小麥幼苗放置NaCl溶液中生長，發現其細胞電解質滲透率顯著降低，葉綠素未被降解，根系活力較高，干物質的積累和植物生長速率提高，說明海藻糖在作物幼苗遭受低溫、鹽害而脫水時，能維持細胞膜結構的穩定性，從而提高了作物的抗逆能力。WU等［21］研究發現，編碼海藻糖-6-磷酸合成酶的Gb TPS使銀杏（Ginkgo biloba）具有高度抗旱、抗寒的能力，通過在組織特異性RT-PCR表達分析，結果顯示：Gb TPS可能參與樹葉的發育機制。

本實驗結果表明Ma TPS1在鹽脅迫下，表達量增加，并在24 h時達到最大，而其他非生物及生物脅迫（鐮刀菌Foc4）的表達水平較正常條件下的低；說明Ma TPS1在逆境脅迫下能夠編碼Ma TPS1蛋白參與調控香蕉抗鹽機制，提高植物的抗鹽性。關于Ma TPS1的研究目前只處于初步預測階段，關于其基因克隆、轉基因水平、細胞水平及分子水平的作用機理需進一步探討。對于香蕉而言，隨著全球變暖和土壤鹽堿化的影響，Ma TPS1的過表達對提高和改良香蕉抗逆新品種具有重要意義。

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（編輯：宋亞珍）

Characterization and Expression Analysis of MaTPS1 from Banana

XU Guiying1，2，XU Biyu3，XING Wenting4，JIA Caihong3，WANG Zhuo3，CHANG Shenghe1，WANG Anbang1，SHU Haiyan1，JIN Zhiqiang1，3*
（1 Haikou Experimental，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570102，China；2 Huazhong Agricultural U-niversity，Wuhan 430070，China；3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China；4 Hainan Provincial Forestry Science Institute，Haikou 571100，China）

A full-length Ma TPS1 of 3 946 bp from banana genome A was obtained.It contains a complete open reading frame of 2 562 bp length，encoding 853 amino acids.Biological information analysis showed that Ma TPS1 protein belongs to the unstable protein，with an isoelectric point of 4.72 and two domains TPS and TPP.Sequence analysis prediction indicated Ma TPS1 is a hydrophobic transmembrane protein without signal peptide and localized in cytoplasm.The amino acid sequence of Ma TPS1 protein has 74.81% homology to the amino acid sequence of other known plant TPS，with 100%，79.91%，71.33%，63.93% and 65.13%to two varieties of Musa acuminata subsp.malaccensis，Zea mays，Camellia sinensis，Coffea canephora.Organ-specific analysis suggested that Ma TPS1 is expressed in banana roots，corms，false stems，leaves，flowers and fruits，but with higher level in roots，corms and flowers.The banana plantlet was treated with ABA，ACC，drought，cold，salt and banana fusarium oxysporum f.sp stress，qRT-PCR analy-sis showed that the expression of Ma TPS1 increased under salt stress，and peaked at 24 h of treatment，while decreased under other biotic and non-biotic stress，which suggested Ma TPS1 may play a role in regulating salt resistance and enhance salt resistance of banana.

banana；trehalose-6-phosphate synthase gene（TPS1）；bioinformatics；expression analysis

Q785；Q786

A

1000-4025（2015）10-1934-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.10.1934

2015-04-17；修改稿收到日期：2015-08-19

農業部重點實驗室開放課題（RRI-KLOF1403），“十二五”農村領域國家科技計劃（2011AA10020605），現代農業產業技術體系建設專項（CARS-32）

許桂鶯（1976—），女，在職博士研究生，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：790741075@qq.com

*通信作者：金志強，博士，研究員，博士生導師，主要從事熱帶果樹分子遺傳學研究。E-mail：zhiqiangjin2001@yahoo.com.cn