氫氣對氧化損傷結腸腺癌細胞的保護作用及機制

穆懷博,盛慶豐,吳偉,呂志葆

(1上海交通大學附屬兒童醫院，上海220000；2上海市兒童醫院)

氫氣對氧化損傷結腸腺癌細胞的保護作用及機制

穆懷博1,2,盛慶豐1,2,吳偉1,2,呂志葆1,2

(1上海交通大學附屬兒童醫院，上海220000；2上海市兒童醫院)

壞死性小腸結腸炎；結腸腺癌；氫氣；Nrf2-ARE信號通路；氧化應激反應

氧化應激導致的炎癥反應是新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)發病的重要原因[1～6]。研究證實，氫氣具有抗氧化和抗炎等作用。本課題組前期研究發現氫氣可明顯提高腸上皮細胞中內源性抗氧化系統關鍵的核轉錄因子Nrf2的表達[7～10]，但具體機制不清楚。因結腸腺癌細胞與腸上皮細胞與對氧化應激的反應相似,故我們于2014年1～8月觀察了氫氣對氧化損傷結腸腺癌細胞的保護作用，間接探討氫氣對氧化損傷腸上皮細胞的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人結直腸腺癌細胞株 Caco-2 及IEC-6購自中國科學院細胞庫。以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于苯并芘、飽和濕度、含 5% CO2的培養箱中培養，細胞呈單層貼壁生長。取對數生長期的細胞進行實驗，細胞密度為 0.5×106～1×106/mL。

1.3 氫氣對Caco-2 細胞線粒體膜電位影響的觀察 取Caco-2 細胞，分組及處理同1.2。處理 30 min后用線粒體熒光染料染色，激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像和熒光信號，檢測線粒體膜電位變化；結果以熒光信號值表示。按試劑盒說明書操作。

1.4 氫氣對Caco-2 細胞丙二醛(MDA)和8-羥基鳥嘌呤(8-OH-G)水平的影響的觀察 取Caco-2 細胞，分組及處理同1.2。處理 24 h后常規消化、離心、洗滌并收集細胞。按照脂質氧化檢測試劑盒 (Abcam 公司)說明書操作，用酶標儀在 532 nm 處測定吸光度值，計算脂質氧化終產物MDA水平;按照核酸氧化 ELISA 檢測試劑盒(Abcam公司)步驟操作，檢測 DNA氧化產物8-OH-G水平。

1.5 氫氣對 Caco-2 細胞凋亡和乳酸脫氫酶(LDH)活性影響的觀察 取Caco-2 細胞，分組及處理同1.2。處理 24 h后常規消化、離心、洗滌并收集細胞。按照 Annexin Ⅴ-FITC 凋亡檢測試劑盒(Molecular Probes 公司)說明書操作，分別加入 Annexin Ⅴ-FITC 和碘化丙啶染色液，進行流式細胞儀檢測(BD 公司)，Annexin Ⅴ-FITC 為綠色熒光，碘化丙啶為紅色熒光，計算凋亡細胞比例。并在熒光顯微鏡下觀察和采集圖像。檢測培養液中LDH活性，結果以U/L表示。按LDH細胞毒性檢測試劑盒(Abcam 公司)說明書操作。

1.6 氫氣對Caco-2 、IEC-6細胞促炎癥因子、抗炎癥因子、轉錄因子Nrf2下游靶基因表達影響的觀察 取對數生長期Caco-2 、IEC-6細胞，分別分為四組(細胞密度為 0.5× 106～1×106/mL)。對照組用RPMI1640培養基培養，模型組用含10 μg/mL抗霉素A的RPMI1640培養基培養，氫氣組(用含 0.6 mmol/L 氫氣的RPMI1640培養基培養；觀察組用含0.6 mmol/L 氫氣和30 μg/mL抗霉素A的RPMI1640培養基培養。處理12 h后，采用RT-PCR法檢測各組促炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)、抗炎癥因子(IL-10)、Nrf2及其下游靶基因血紅素氧合酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、連環蛋白(Cat)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)基因表達。各引物序列根據GenBank中的相應引物序列設計，由上海生工生物工程有限公司合成。結果以相對表達量表示。按試劑盒說明書操作。

2 結果

表1 各組Caco-2 細胞內和·OH比較

注：與模型組相比，*P<0.05。

2.2 Caco-2 細胞線粒體膜電位 觀察組為67 890±989，對照組為96 541±1 245，模型組為47 890±768；觀察組低于對照組，高于模型組(P均<0.05)。

2.3 Caco-2 細胞MDA和8-OH-G水平 各觀察組 Caco-2 細胞內MDA和8-OH-G水平均低于模型組(P均<0.05)，與對照組相比差異無統計學意義。見表2。

表2 各組Caco-2 細胞內MDA和8-OH-G水平比較

注：與模型組相比，*P<0.05。

2.4 Caco-2 細胞凋亡率和LDH水平 觀察組 Caco-2 細胞凋亡率和LDH活性均低于模型組(P均<0.05)，與對照組相比差異無統計學意義。見表3。

2.5 Caco-2 、ICE-6 細胞促炎癥因子、抗炎癥因子、Nrf2及其下游靶基因表達 Caco-2及ICE-6細胞促炎癥因子、、抗炎癥因子、轉錄因子Nrf2及其下游靶基因表達分別見表4～7。由表4～7可見，模型組Caco-2、ICE-6細胞促炎癥因子水平高于對照組升高(P均<0.05)。觀察組Caco-2、ICE-6細胞促炎癥因子水平低于較模型組(P均<0.05)，高于對照組(P>0.05)；模型組抗炎癥因子水平高于模型組(P均<0.05)，低于對照組(P均>0.05)；細胞轉錄因子Nrf2及其下游靶基因水平高于模型組(P均<0.05)及對照組(P均>0.05)。

表3 各組Caco-2 細胞凋亡率和LDH水平比較

注：與模型組相比，*P<0.05。

表4 Caco-2細胞各組促炎癥因子、抗炎癥因子表達比較(n=8，相對表達量，

表5 各組Caco-2細胞轉錄因子Nrf2及其下游靶基因表達比較(n=8，相對表達量，

表6 各組ICE-6細胞促炎癥因子、抗炎癥因子表達比較(n=8，相對表達量，±s)

表7 各組ICE-6細胞轉錄因子Nrf2及其下游靶基因表達比較(n=8，相對表達量，±s)

3 討論

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷[8, 9]。急性氧化應激反應可通過直接或間接損傷DNA引起組織的嚴重損傷，持續慢性的氧化應激反應亦被認為是多種常見疾病(包括腫瘤)的發病原因之一。氧化損傷細胞的特征性表現為，線粒體內活性氧聚集,氧自由基水平升高；進而膜電位下降，線粒體膜通透性增加，釋放細胞因子；細胞因子與Caspase家族結合，進而誘導細胞凋亡[16～18]。

研究發現，轉錄因子相關因子2(Nrf2)是細胞氧化應激反應中的關鍵因子,是細胞抗氧化還原的中樞調節者,Nrf2通過與抗氧化反應元件(ARE)相互作用,誘導編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達,在細胞的防御保護中發揮重要作用。本研究觀察了氫氣對氧化應激損傷細胞 Nrf2-ARE 信號通路的調節作用。Nrf2屬于鋅指蛋白 (bZIP)Cap 'n' Collar 家族中的一員，可激活多種細胞保護性蛋白的表達[13, 17]。本研究觀察組Caco-2細胞和IEC-6細胞受到抗霉素A誘導的氧化損傷時，Nrf2 mRNA和蛋白表達有所上升，這可能是細胞自身的適應性反應，說明細胞已經啟動抗氧化損傷的保護機制。研究證實，細胞受到氧化損傷后會引發一系列炎癥反應，促炎癥因子表達升高。本研究模型組炎癥因子水平明顯高于對照組，而氫氣組明顯低于模型組，說明氫氣對炎癥因子的釋放有抑制作用，可抑制細胞內炎癥反應的發生。研究證實，Nrf2的下游基因均參與了細胞內清除自由基和炎癥反應。本研究觀察組及模型組Nrf2及其下游基因表達均升高，而觀察組表達明顯高于模型組；提示兩組細胞Nrf2-ARE通路均被激活，此可能為氫氣抗氧化損傷作用的分子生物學基礎。

綜上所述，氫氣能夠降低抗霉素A誘導的結腸癌腺細胞內氧化損傷，表現為清除細胞內自由基，修復氧化損傷的線粒體膜電位，降低氧化代謝產物，抑制細胞凋亡，這一保護作用可能是通過調節Nrf2-ARE通路實現的。

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Protective effect of hydrogen saline in oxidative stress insulted enterocytes

MUHuai-bo1,SHENGQing-feng,WUWei,LVZhi-bao

(1Children′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai220000,China)

necrotizing enterocolitis; human colon adenocarcinoma; hydrogen; Nrf2-ARE signaling pathway;oxidative stress

上海市科委引導類重點課題(124119a6500)。

穆懷博(1986-)，男，醫學碩士，住院醫師，研究方向為兒童腫瘤、遺傳代謝性和出生缺陷性疾病。E-mail:bloodmmf@126.com

通信者簡介：呂志葆(1963-)，男，醫學博士，教授，主任導師，研究方向為兒童腫瘤、遺傳代謝性和出生缺陷性疾病。E-mail:lvzhibao@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.002

R34

A

1002-266X(2015)06-0004-04

2014-12-05)