人臍帶來源的間充質干細胞再次培養效果觀察

高彥琳, 張寧坤, 陳厚良, 高連如, 朱智明

(中國人民解放軍海軍總醫院,北京100000)

·基礎研究·

人臍帶來源的間充質干細胞再次培養效果觀察

高彥琳, 張寧坤, 陳厚良, 高連如, 朱智明

(中國人民解放軍海軍總醫院,北京100000)

目的 探討人臍帶來源間充質干細胞(hUC- MSCs )體外培養的最佳方法。方法 采用組織塊貼壁法分離培養hUC- MSCs,記為初次培養組。將原代培養瓶中的培養液及組織離心，重新分成再次培養組織組、再次培養混合組和再次培養純液組進行再次培養。觀察四組原代細胞的細胞形態、獲得時間和細胞得率；MTT法繪制細胞生長曲線， 流式細胞儀檢測細胞周期及免疫表型。結果 初次培養組、再次培養組織組、再次培養混合組、再次培養純液組獲取細胞的平均時間分別為(15±0.45)d、(7±0.30)d、(8±0.25)d、(8±0.25)d。每個T75培養瓶可獲取的第1代細胞數分別為(4.0±0.50)×105、(9.0±0.55)×105、(15.0±0.20)×105、(7.0±0.33)×105個。倒置顯微鏡下觀察四組細胞為形態相對均一的梭形貼壁細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長。四組細胞的生長曲線、增殖活性、表面標記物檢測均無明顯差異。結論 對臍帶間充質干細胞的原代培養體系進行再次培養，可在短時間內擴增出大量原代細胞。

間充質干細胞；臍帶；細胞培養

間充質干細胞(MSCs)是進行細胞療法的主要種子細胞[1], 具有較強的自我更新能力和多向分化潛能，在細胞治療領域有著極為廣闊的應用前景[2，3]。目前已從骨髓、 脂肪、 羊膜、 胎盤、 臍血以及臍帶等組織中分離出MSCs，其有向內皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞和神經細胞分化的能力[4～6]。 臍帶的來源廣泛，取材方便，易于收集、保存、冷凍，屬于醫療廢棄物，不受倫理、道德及法律方面的限制，且臍帶組織中MSCs含量豐富，是再生醫學理想的種子細胞[7]。目前分離培養臍帶血來源的間充質干細胞(hUC-MSCs )的方法很多，但是都不能快速有效地獲取原代細胞。2014年1～5月，我們觀察并比較了對hUC-MSCs原代培養體系進行再次培養所獲得hUC-MSCs的形態，獲得hUC-MSCs 時間及數目，獲得hUC-MSCs 細胞表型、增殖能力、周期分布，探討最佳的hUC- MSCs 培養方法。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍帶來源 經醫院倫理委員會的批準， 在征得產婦和家屬書面知情同意的情況下， 在海軍總醫院婦產科產房取當日剖宮產健康足月生產的新生兒臍帶 (乙型肝炎病毒、 丙肝病毒、 人類免疫缺陷病毒、 TP-SX、巨細胞病毒梅毒、艾滋病等傳染性疾病檢測陰性)。

1.1.2 主要試劑及器材 DMEM/F12培養液、胎牛血清(FBS)、0.25%trypsin-EDTA胰蛋白酶均為美國 Gibco 公司生產；MTT為Sigma公司生產；流式單抗CD45-FITC、CD44-FITC、CD90-PE、 CD105-PE、HLA-ABC-PE、HLA-DR-FITC、CD31-PE 均為美國Biolegend 公司生產；倒置相差顯微鏡下為日本Nikon公司生產；流式細胞儀為美國 BD 公司生產；紫外分光光度儀、 二氧化碳培養箱(Thermo)。

1.2 hUC-MSCs分離及培養

1.2.1 hUC-MSCs的原代培養 將無菌條件下獲取的臍帶放入無菌生理鹽水中，1 h內送至細胞培養實驗室。參照Li等[8]報道的hUC-MSLs分離、培養方法。用生理鹽水反復沖洗，洗去臍帶殘留血液，將臍帶剪成3～4 cm的小段，每段均沿臍靜脈腔剪開，平鋪后剔除靜脈，再剔除2根動脈，取出血管之間、血管與外膜之間的膠狀物——華通膠，用小剪刀將取出的華通膠反復剪切成大約1 mm3及以下小塊，接種于T75培養瓶內，每個培養瓶內加入10 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培養液，使臍帶華通膠均勻分布瓶底，置于5%CO2、37 ℃的培養箱內培養。在顯微鏡下觀察細胞生長增殖情況并拍照。待細胞生長至80%～90%融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細胞，為初次培養組。

1.2.2 hUC-MSCs再次培養 將原代培養瓶中的培養液及組織移入離心管中，1 500轉/min離心5 min。將此體系分成三組，并分別接種于T75培養瓶內。再次培養組織組：單純組織塊組(無原培養基)加入10 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培養液；再次培養混合組：組織塊及原培養基的混合物組加入5 mL含有10%FBS 的 DMEM/F12 培養及5 mL原培養液；再次培養純液組：原培養液10 mL，分別置于5%CO2、37 ℃的培養箱內培養。在顯微鏡下觀察細胞生長增殖情況并拍照。待細胞生長至80%～90%融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細胞。

1.3 觀察項目及方法

1.3.1 hUC-MSCs形態、第一代細胞獲取時間及數量 采用倒置顯微鏡觀察四組hUC-MSCs形態。統計各組獲取第一代hUC-MSCs的時間及每個培養瓶獲取hUC-MSCs的數量。

1.3.2 hUC- MSCs 表面標記物 取各組第3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗兩次，調整細胞濃度為1×106/mL單細胞懸液，每個Eppembrf 管加 100 μL的細胞懸液 , 加入鼠抗人單克隆抗體 PE- CD90PE- CD105PE- CD44PE-CD73PE- HLA- ABC FITC- CD45FITC- CD34FITC- HLA- DR各 20 μL，充分混勻，避光室溫孵育30 min， PBS 洗 2 遍(250 g 離心 5 min )，重新制成細胞懸液 0.5 mL，經300目細胞篩過濾，流式細胞儀上機檢測并分析。

1.3.3 細胞增殖活性 取各組第3代細胞， 經0.25%胰蛋白酶消化計數后，分別用完全培養基調整細胞數至2.5 × 104/mL，取200 μL細胞懸液接種在96孔板中,每組設6個復孔，置于37 ℃ 5%CO2飽和濕度培養箱中培養。每隔24 h用MTT法檢測各組細胞吸光度值(激發波長490 nm)，連續7 d，取6孔均值繪制生長曲線。

1.3.4 細胞周期分布 取各組第3代細胞，經0.25%胰蛋白酶消化收集后，分別用 PBS 離心洗滌 2 次，調整細胞數至 1×106/mL，離心棄上清，加入4 ℃預冷的70%乙醇1 mL重懸，4 ℃冰箱過夜; 離心棄上清，用1 mL碘化丙啶重懸，4 ℃避光孵育 30 min，流式細胞儀檢測，分析細胞周期。

2 結果

2.1 hUC-MSCs形態、得第一代細胞獲取時間及數量 倒置顯微鏡下觀察四組原代細胞呈貼壁生長，形態均為長梭形或多角形1。初次培養組細胞以華通膠為中心呈旋渦狀或平行排列生長，獲取細胞的時間為(15.00±0.45)d,每個培養瓶可獲取(4.00±0.5)×105個第一代細胞；再次培養組織組細胞以華通膠為中心呈旋渦狀生長，獲取細胞的平均時間為(7.00±0.3)d,每個培養瓶可獲取(9.00±0.55)×105個第一代細胞；再次培養混合組部分細胞以華通膠為中心呈旋渦狀生長，部分細胞呈散在生長，得到原代細胞的時間(8.00±0.25)d,每個培養瓶可獲取(15.00±0.20)×105個第一代細胞；再次培養純液組細胞呈散在生長，得到原代細胞的平均時間(8.00±0.58)d,每個T75培養瓶可獲取(7.00±0.33)×105個第一代細胞。傳至第3 代， 細胞增殖速度加快，形態較為均一呈長梭形，折光度好。四組第一代及第3代hUC-MSCs細胞形態無明顯差異，初次培養組原代細胞獲取時間顯著長于其他三組(P均<0.05)，再次培養的三組之間兩兩比較，P均>0.05。獲取原代細胞數再次培養混合組數目最多，再次培養組織組其次，再次培養純液組稍差，初次培養組最少，四組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 hUC-MSCs免疫表型 四組第3代臍帶間充質干細胞均高表達CD90、CD105、HLA-ABC，不表達 CD31、CD34、CD45、HLA- DR。

2.3 hUC-MSCs增殖能力 四組第3代hUC- MSCs細胞生長曲線見圖1。四組hUC- MSCs 生長曲線形態相似，基本重疊。第1～2 d各組細胞處于潛伏期，增殖不明顯; 3～5 d各組細胞進入對數生長期， 細胞增殖加速; 第 6 天以后進入平臺期，細胞生長停滯。

圖1 四組hUC-MSCs 生長曲線

2.4 hUC-MSCs細胞周期分布 各組細胞周期分布無統計學差異。

3 討論

最近幾年里，對成體干細胞療法的研究在不斷增加。MSCs是一個相當具有吸引力的種子細胞，可以用于治療各種疾病，包括神經系統疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、內分泌疾病等[9]。hUC- MSCs 是介于胚胎干細胞和成體干細胞之間的原始干細胞，分化能力強，倍增時間短，具有免疫調節作用和較低的免疫原性，且無致腫瘤性[10，11]。1976年Friedenstein等[12]首先從臍帶組織中分離培養出間充質干細胞，之后Schugar等[13]采用組織塊法和酶消化法兩種方法分別培養出臍帶間充質干細胞，這也是目前較為常用的兩種方法。這兩種方法分離培養出的臍帶間充質干細胞形態、 生長曲線、 細胞表面標記物等無明顯差異[14]。但是酶消化法成本較高；操作比較繁瑣污染概率大；消化過程時間過短，細胞很難爬出；消化時間過長易損傷細胞；長時間酶的消化對細胞損傷較大, 多次傳代后細胞易脫落死亡[15]。

本研究采用組織塊培養法提取臍帶中MSCs。通常來講組織塊貼壁法是將小的組織塊均勻鋪于培養瓶底，原代細胞從組織塊邊緣爬出。雖然組織塊貼壁法方便易行，操作簡單，但存在原代細胞收獲率低、培養周期長等問題[16]，難以適應組織工程對種子細胞的需要。本研究中初次培養組獲取原代細胞的平均時間大約2周,獲取細胞數量較少，符合組織塊貼壁法培養的結果。一般傳代結束后就會將培養原代細胞的組織和培養液丟棄。本研究中筆者將廢棄的組織和培養液離心后，分成組織組、混合組和純液組進行再次培養，大約1周即可傳代，且獲取的細胞數為初次培養的2倍左右。相對于傳統組織貼壁法，這種改進的方法可在較短時間內獲得大量原代細胞，而且獲得細胞的免疫表型、增殖能力及周期分布正常。筆者推測其原因：①初次培養后組織塊內細胞并未完全爬出；②初次培養過程中可能形成了某些黏附物質和生長因子，促進組織塊貼壁和生長[17]；③組織塊在經過一輪培養后，纖維組織松解，細胞易于爬出；④原代培養的培養液中可能存在一些散在細胞。

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國家自然科學基金面上項目(81170094)。

朱智明

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.010

R318

A

1002-266X(2015)06-0028-03

2014-10-15)