人類軟骨糖蛋白-39對成人膝關節軟骨祖母細胞增殖的影響

陳躍平，董盼鋒，章曉云，袁振中，饒毅

(1廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧530011；2廣西中醫藥大學)

·論著·

人類軟骨糖蛋白-39對成人膝關節軟骨祖母細胞增殖的影響

陳躍平1，董盼鋒1，章曉云2，袁振中2，饒毅2

(1廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧530011；2廣西中醫藥大學)

目的 觀察人類軟骨糖蛋白-39(HCgp-39)對成人膝關節軟骨祖母細胞增殖的影響。方法 取正常及OA關節軟骨標本，向分離培養所得的軟骨祖母細胞中分別加入0、25、50、100、500 ng/mL的HCgp-39。收集培養0、24、48、72 h的細胞，加入10 μL的MTS檢測液，酶標儀檢測各孔光的吸收值(OD值)，比較各組細胞對HCgp-39的敏感性。結果 OA組：48 h時加入25、50、100、500 ng/mL組的OD值分別為0.81±0.01、0.88±0.02、0.93±0.01、1.03±0.04；72 h分別為1.02±0.05、1.12±0.01、1.21±0.01、1.28±0.01；與未加入HCgp-39組比較均有統計學差異(P<0.05或<0.01)；正常軟骨組：48 h時加入25、50、100、500 ng/mL組的OD值分別為0.67±0.01、0.63±0.01、0.61±0.01、0.58±0.01；72 h分別為1.18±0.02、1.1±0、1.08±0.01、0.97±0.02；與未加入HCgp-39比較均有統計學差異(P<0.05或<0.01)。結論 在成人的關節軟骨中存在軟骨祖母細胞；HCgp-39能夠促進關節軟骨中軟骨祖母細胞的增殖。

骨關節炎；軟骨祖母細胞；人類軟骨糖蛋白-39；細胞增殖

骨關節炎(OA)是一種以病變累及關節軟骨、并繼發的骨質增生為特點的慢性退行性關節疾病。OA在60歲以上人群中的發病率高達49%，好發于膝關節[1]。以往認為，成人軟骨中僅含有終末分化的軟骨細胞，而缺乏具有多向分化潛能的干細胞，但近年研究表明，在軟骨表層可能存在具有分化功能的細胞系[2]。人類軟骨糖蛋白-39(HCgp-39)是關節軟骨自身分泌的細胞因子，主要來源于關節軟骨細胞、滑膜細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞等，OA時患者血清和關節液中HCgp-39含量明顯增加，因此推測，HCgp-39異常增高可能與軟骨組織的病理變化有關，并在一定程度上參與了軟骨組織的重建和細胞外基質的合成。2012年7月～2013年12月，我們觀察了HCgp-39對成人膝關節軟骨祖母細胞增殖的影響，探討HCgp-39參與OA的機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 正常標本與OA關節軟骨標本分別取自1例股骨髁骨折行手術治療的青年患者(男，34歲,右股骨髁粉碎性骨折，行切開復位內固定術)和1例因OA行關節置換的老年患者(女，61歲，左膝骨關節炎，行左膝人工關節置換術)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集受試者股骨髁間窩非負重區的關節軟骨標本，立即送實驗室，嚴格按照無菌要求剔除軟骨組織上的軟組織及血瘀塊，并將其剪切成大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的軟骨塊，置4%多聚甲醛中固定5 d，再置于15% EDTA溶液中脫鈣4周。常規乙醇脫水，包埋，5 μm厚連續切片，行蘇木精伊紅染色與番紅O染色。光鏡下觀察，每張切片選擇3個不同視野，參照Mankin[3]軟骨病理評分標準進行評分。

1.2.2 軟骨祖母細胞的分離、培養與鑒定 將軟骨組織剪碎成2 mm×2 mm的小塊，加入0.125%的胰酶消化，將消化處理后的軟骨組織塊重新剪碎成1 mm×1 mm的小塊，平鋪于含有H-DMEM培養基的培養瓶中，倒置培養4 h后翻瓶繼續培養。

1.2.3 軟骨祖母細胞的表型鑒定及分離培養 將傳至2代的細胞濃度調整為1×107/100 μL進行培養，并行CD166和CD105抗原流式檢測，確定軟骨祖母細胞(CD166+和CD105+的細胞)的百分率后，對其再次進行擴大培養，細胞傳至第3代時，采用流式分選的方法分離提取能夠表達CD105/CD166的細胞(軟骨祖母細胞)并進行純度檢測。

1.2.4 HCgp-39處理軟骨祖母細胞 向分離培養的軟骨祖母細胞中分別加入0、25、50、100、500 ng/mL的HCpg-39，消化細胞后吹打散細胞，計數，調整細胞濃度至1×105個/mL，加入96孔板中，100 μL/孔；待細胞貼壁后，收集HCgp-39作用0、24、48、72 h的細胞檢測，并加入比例為1∶10的MTS，孵育4 h后，采用酶標儀進行讀板，讀取MTS檢測OD490數據。不同濃度不同時間點分別檢測3次。

2 結果

2.1 原代細胞及傳代后形態觀察 分離培養正常原代軟骨細胞貼壁后，細胞呈多角型，扁平狀，胞質豐富，可見清晰、圓形的細胞核，部分區軟骨細胞集落樣生長；OA原代軟骨細胞形態多不規則，似成纖維細胞，貼壁較正常軟骨細胞晚，生長速度也明顯較正常軟骨細胞慢，且多為單層生長，結節樣細胞群和集落樣生長少見。正常軟骨細胞傳代培養后細胞仍似橢圓形,細胞胞質豐富，隨傳代次數不斷增加,細胞集落中的梭形細胞數目逐漸增多；OA軟骨細胞傳代培養后大部分會恢復到原來的梭形或短梭形，細胞突起會逐漸變長并向多角形演化，最終形成多角形，融合時間明顯延長。

2.2 軟骨祖母細胞的流式分選及純度檢測 在正常關節來源的軟骨細胞中和OA關節來源的軟骨細胞中均能分離出能夠表達CD105及CD166的細胞(軟骨祖母細胞)分別為2.29%和2.68%。對從正常關節和OA關節來源的軟骨祖母細胞進行傳代培養，并對最終培養所得的OA軟骨祖細胞和正常軟骨祖母細胞分選后細胞純度檢測分別為96.96%和92.97%。

2.3 不同濃度HCgp-39對兩組軟骨祖母細胞增殖的影響 見表1、表2。

2.4 不同濃度HCgp-39作用于兩組軟骨祖母細胞后祖母細胞增殖率的變化趨勢 見圖1、圖2。

3 討論

Chen等[4]利用電子掃描顯微鏡對從軟骨和骨髓中分離得到的直徑<5 mm的小細胞的超微結構進行分析，發現來自軟骨的小細胞與來自骨髓的小細胞一樣，均具有分化成軟骨細胞的潛能。Barbero等[5]對人關節軟骨中提取的細胞進行培養，對成軟骨、成骨和成脂細胞進行誘導分化，結果顯示，人關節軟骨細胞中，有一部分細胞能夠被誘導分化成軟骨細胞、脂肪細胞和骨細胞，且其分化能力的大小受細胞中轉化生長因子β1及成纖維細胞生長因子2的影響。這些研究進一步說明，軟骨中可能具有多向分化潛能的軟骨祖母細胞存在。國際細胞治療學會對干細胞的界定包括3點：在標準的培養條件下有黏附可塑性；表達CD105、CD90和CD73；缺乏CD34、CD45、CD14、CD79α、CD11b或CD19及HLA-DR表面分子的表達。Alsalameh等[6]采用免疫磁珠分離的方法也證實，無論是人的正常軟骨組織還是發生OA的軟骨中，均存在表達CD105/CD166的細胞(軟骨祖母細胞)，且此類細胞經誘導培養后能夠被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞及成脂肪細胞，而且在發生OA的軟骨中表達CD105/CD166的細胞要明顯多于正常軟骨組織中的細胞。以上研究均說明，在關節軟骨中存在具有多向分化潛能的干細胞。HCgp-39是殼質酶家族成員，相對分子量約為39 000，由分布于8 kb區域上的10個外顯子構成。HCgp-39主要來源于關節軟骨細胞、滑膜細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞，但其并不具備殼質酶活性[7]。目前認為，其可能與組織重建和細胞外基質的合成有關。HCgp-39在炎癥性關節疾病患者血液和關節滑液中的表達高于正常關節，且在成人骨與關節重塑過程中能夠階段性和特異性表達[8]。Johansen等[9]對476例健康兒童、260例健康成人和63例創傷患者、54例OA患者進行測定，發現70歲以上人群和重度膝OA患者血清和關節液中HCgp-39水平明顯增高，推測HCgp-39的增高可能與軟骨的病理變化有關，可在一定程度反映炎癥反應的程度和關節軟骨降解破壞的程度，是關節破壞的一個診斷性標記物。在細胞培養中也發現HCgp-39對豚鼠軟骨細胞和兔軟骨細胞具有促有絲分裂作用，且具有劑量依賴性[10]，說明HCgp-39在組織重塑過程中具有一定作用。

表1 不同濃度 HCgp-39對OA軟骨祖母細胞增殖 的影響

表2 不同濃度 HCgp-39對正常軟骨祖母細胞增殖 的影響

圖1 不同濃度HCgp-39對OA軟骨祖母細胞 增殖率的影響

圖2 不同濃度HCgp-39對正常軟骨祖母細胞 增殖率的影響

本研究顯示，向OA組關節軟骨祖母細胞中加入HCgp-39后，檢測各孔的OD值，結果第2天及第3天各劑量組與未加入HCgp-39相比均有統計學差異；OA軟骨祖母細胞的增殖率隨藥物濃度的增加及作用時間的延長而呈增大趨勢。有研究表明，HCgp-39主要在OA軟骨的表層和中層表達，而在正常人的軟骨中并不表達[11]。也有研究證實，OA患者血清HCgp-39水平與IL-6和CRP水平呈正相關，且隨著病程延長及患者活動功能受限，血清HCgp-39濃度也會相應增加。在正常軟骨組織中，軟骨細胞的基質中各種成分的新陳代謝是一種緩慢的過程，軟骨細胞基質分解與合成處于動態的平衡狀態，但當這種內環境的平衡狀態被打破，軟骨細胞就會產生大量HCgp-39。有學者[12]研究了軟骨細胞中HCgp-39的分泌規律，結果發現，即使在分離的正常軟骨細胞培養的早期，作為對細胞外環境的反應，HCgp-39的分泌也會明顯升高。因此推測，當由于不同原因導致關節軟骨受損，誘發OA或者軟骨周圍的環境發生改變時，可能會激活軟骨組織重建修復過程，在重建修復過程中刺激HCgp-39的分泌增多。在向正常軟骨組的關節軟骨祖母細胞中加入HCgp-39后，經過72 h培養，檢測各孔光的OD值。結果第2天及第3天各劑量組與未加入HCgp-39相比均有統計學差異；正常軟骨祖母細胞的增殖率隨藥物濃度的增加及作用時間的延長而呈減小的趨勢。說明HCgp-39作用于正常軟骨祖母細胞后，在一定時間內能夠促進祖母細胞的增殖，而升高到一定程度時又表現為增殖受抑制的效應。Knorr等[13]發現，正常關節軟骨內存在一定水平的HCgp-39，但其在正常軟骨中的作用并不清楚。我們推測，HCgp-39在正常軟骨組織中可能具有與TGF-β相似的作用，即在一定程度上能夠抑制軟骨細胞的增生肥大和鈣化，使得軟骨中始終保持一定數量具有潛在分化功能的母細胞，而當這種細胞的數量達到一定程度時，便會產生負反饋效應，使得HCgp-39的促軟骨祖母細胞分裂增殖的作用減弱，與開始加入HCgp-39時相比，軟骨祖母細胞的增殖率明顯下降。

OA的發生發展是一個長期、慢性和逐步漸進的過程，涉及全身和局部的許多因素。其始動環節是關節軟骨的退變，包括軟骨細胞增殖與凋亡、合成能力的改變、降解增快、骨贅形成及細胞表型改變等。HCgp-39作為軟骨自身分泌的細胞因子，無論對來自于OA患者軟骨中的軟骨祖母細胞還是來自于正常軟骨中的軟骨祖母細胞，均在一定時間內具有促進其增殖的作用。然而，這兩種來源的細胞對HCgp-39的反應又有所不同，其具體的影響因素及機理仍需進一步研究。

[1] Lawrence RC, Felson DT, Helmick CG, et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States[J]. Part II.Arthritis Rheum, 2008,58(1):26-35.

[2] Hattori S, Oxford C, Reddi AH. Identification of superficial zone articular chondrocyte stem/progenitor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007,358(1):99-103.

[3] 方銳,艾力江·阿斯拉,盧勇,等.兔骨性關節炎模型構建及早中晚期的特點[J].中國組織工程與臨床康復,2010,14(7):1218-1222.

[4] Chen MH, Lin S, Hsieh CH, et al. Identification and initial characterization of small cells in adult cartilage and bone marrow[J]. J Formos Med Assoc, 2004,103(4):264-273.

[5] Barbero A, Ploegert S, Heberer M, et al. Plasticity of clonal populations of dedifferentiated adult human articular chondrocytes[J]. Arthritis Rheum, 2003,48(5):1315-1325.

[6] Alsalameh S, Amin R, Gemba T, et al. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J]. Arthritis Rheum, 2004,50(5):1522-1532.

[7] Volck B, Price PA, Johansen JS, et al. YKL-40,a mammalian member of the chitinase family,is a matrix protein of specific granules in human neutrophils[J]. Proc Assoc Am Physicians, 1998,110(4):351-360.

[8] Vos K, Steenbakkers P, Miltenburg AM, et al. Raised human cartilage glycoprotein-39 plasma levels in patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory conditions[J]. Ann Rheum Dis, 2000,59(7):544-548.

[9] Johansen JS, Hvolris J, Hansen M, et al. Serum YKL-40 levels in healthy children and adults.Comparison with serum and synovial fluid levels of YKL-40 in patients with osteoarthritis or trauma of the knee joint[J]. Br J Rheum, 1996,35(6):553-559.

[10] De Ceuninck F, Gaufillier S, Bonnaud A, et al. YKL-40(cartilage gp-39)induces proliferative events in cultured chondrocytes and synoviocytes and increases glycosaminoglycan synthesis in chondrocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001,285(4):926-931.

[11] Volck B, Ostergaard K, Johansen JS, et al. The distribution of YKL-40 in osteoarthritic and normal human articular cartilage[J]. Scand J Rheumatol, 1999,28:171-179.

[12] 蘇曉恩,魏波,鄧超樺.YKL-40在骨關節炎軟骨細胞中的表達及意義[J].湖北醫學,2011,17(9):1140-1142.

[13] Knorr T, Obermayr F, Bartnik E, et al. YKL-39 (chitinase 3-like protein 2),but not YKL-40 (chitinase 3-like protein 1), is up regulated in osteoarthritic chondrocytes[J]. Ann Rheum Dis, 2003,62(10):995-998.

Effect of human cartilage glycoprotein-39 on proliferation of precartilaginous stem cells of adult articulear cartilage

CHENYue-ping1,DONGPan-feng,ZHANGXiao-yun,YUANZhen-zhong,RAOYi

(1RuikangHospitalAffiatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China)

Objective To investigate the effect of HCgp-39 on adult articular cartilage precartilagincus stem cells proliferation. Methods HCgp-39(0, 25, 50, 100, 500 ng/mL) were added into precartilaginous stem cells. After 0, 24, 48, 72 h, stem cells were collected, and subjected to 10 μL MTS, and then detecting OD490, comparing the cell sensibility to HCgp-39 in all groups. Results OA group: After 24 hours, the mean and standard deviation of cells subjected to 25, 50, 100, 500 ng/mL HCgp-39 were 0.81±0.01, 0.88±0.02, 0.93±0.01, 1.03±0.04, separately; after 72 hours, the mean and standard deviation were 1.02±0.05, 1.12±0.01, 1.21±0.01, 1.28±0.01, separately. When Compared with stem cells without subjecting to HCgp-39, there was no statistically differences; normal group: after 24 hours, the mean and standard deviation were 0.67±0.01, 0.63±0.01, 0.61±0.01, 0.58±0.01; after 72 hours, the mean and standard deviation were 1.18±0.02, 1.1±0, 1.08±0.01, 0.97±0.02; comparing with cells without subjecting to HCgp-39, the differences were statistically significant. Conclusions There are articular cartilage cell proliferation in the adult articular cartilage; HCgp-39 had the promotional effects on proliferation of precartilaginous stem cells.

osteoarthritis; precartilaginous stem cells; human cartilage glycoprotein-39; proliferation of cells

廣西醫療衛生重點科研課題(重2010097)。

陳躍平(1970-)，男，主任醫師，教授，碩士生導師，研究方向為股骨頭缺血壞死的診治。E-mail: chenyueping007@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.001

R684.3

A

1002-266X(2015)01-0001-04

2014-08-22)