植物內生菌抗菌活性物質及其在果蔬采后保鮮中的應用進展

周金偉, 周紅麗, 柏連陽, 易有金*,李高陽, 夏 菠, 隆麗林

(1.湖南農業大學食品科技學院/食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,長沙 410128;2.湖南農業大學植物保護學院,長沙 410128;3.湖南省農業科學院農產品加工研究所,長沙 410128)

植物內生菌抗菌活性物質及其在果蔬采后保鮮中的應用進展

周金偉1, 周紅麗1, 柏連陽2, 易有金1*,李高陽3, 夏 菠1, 隆麗林1

(1.湖南農業大學食品科技學院/食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,長沙 410128;2.湖南農業大學植物保護學院,長沙 410128;3.湖南省農業科學院農產品加工研究所,長沙 410128)

植物內生菌是寄生在植物組織中的一大類群特殊微生物,過去長期被忽略。然而越來越多的研究表明,植物內生菌是新型抗菌藥物的寶貴資源,其代謝產物中存在一系列具有多樣性結構的抗菌活性化合物。本文對近年來植物內生菌產生的抗菌活性物質及其抗菌效果進行了綜述,簡要介紹了植物內生菌在果蔬采后保鮮中的應用,同時總結了植物內生菌抗菌活性物質在當前實際研究中所遇到的問題。

內生菌; 抗菌物質; 抗菌活性; 果蔬; 采后保鮮

當前,由各種病原菌引起的疾病正日益危害著人類的健康和生命,而化學藥物的濫用加劇了許多致病菌產生耐藥性[1]。因此,尋求新型、安全、高效的天然抗菌藥物成為當務之急[2]。從微生物次級代謝產物中篩選生物活性物質是新藥研究與開發的一個重要途徑,為尋找能夠產生新型抗菌藥物的微生物資源,植物內生菌近年來成為研究的熱點[3]。植物內生菌能產生多種抗菌活性物質,且這些物質有許多是尚未開發的新物質[4]。本文以化合物結構類型為線索,對近年來植物內生菌產生的抗菌活性物質進行綜述,并對植物內生菌在果蔬保鮮中的應用進行簡要討論。

1 植物內生菌產生的抗菌活性物質

1.1 生物堿

生物堿是天然產物中最大的一類化合物,多數具有抗菌活性。

從丹參內生細菌Pseudomonas brassicacearum subsp.neoaurantiaca中分離到1個抗菌生物堿(圖1a),該化合物對腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的MIC值均為50μg/m L[5],能有效保護丹參免受病原真菌的侵染。Du等[6]從鼠尾藻內生真菌Eurotium cristatum中分離出2個新的吲哚類生物堿cristatumins A和D(圖1b,c)和2個同系物(圖1d,e),其中化合物d和e對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有很強的抗菌活性,其MIC分別為64和8μg/m L,活性略低于氯霉素(4μg/m L)。

內生曲霉產生的2個生物堿fumigaclavine C(圖1g)和pseurotin A(圖1h)對大腸桿菌和綠膿假單胞菌等病原細菌的抗菌效果顯著[7]。藏紅花內生青霉產生的吡咯生物堿(圖1i)對白念珠菌、新型隱球菌和紅色毛癬菌的MIC80介于16～64μg/mL[8]。從馬錢子內生真菌Gliocladium sp.的發酵物中發現的二酮哌嗪生物堿(圖1j)在43.4μg/mL時對藤黃微球菌有很強的抗菌活性[9]。

圖1 內生菌產生的具有抗菌活性的生物堿類化合物(a～j)Fig.1 Antimicrobial alkaloids(a-j)from endophytes

1.2 萜類

內生木霉能產生2個新倍半萜化合物(圖2c, d),對大腸桿菌、葡萄球菌和皮炎單孢枝霉的最小抑制劑量為25～150μg/disk[10]。

Gao等[11]從內生黃青霉中獲得2個具有廣譜抗菌活性的新四環二萜conidiogenones H和I(圖2e,f)。褐藻內生真菌Aspergillus wentii產生的二萜化合物(圖2g)對白念珠菌的MIC為16μg/m L[12]。重樓內生菌Pichia guilliermondii產生的三萜化合物煙曲霉酸(圖2h)對9個供試細菌的MIC為1.56～50μg/mL,對稻瘟病菌孢子萌發的IC50為7.20μg/mL[13]。此外,從內生真菌Ulocladium sp.的發酵物中分離出3個具有抗菌活性的新的混合萜類tricycloalternarenes F-H(圖2i～k)[14]。

圖2 內生菌產生的具有抗菌活性的萜類化合物(a～k)Fig.2 Antimicrobial terpenoids(a-k)from endophytes

1.3 肽類

微生物產生的肽類物質由非核糖體合成,大多具有抗菌活性。

從Catunaregam tomentosa中獲得的內生真菌Curvularia geniculata能產生1個新的肽類-聚酮化合物curvularides B(圖3a),對白色念珠菌有抑菌活性[15]。該化合物與抗真菌藥物氟康唑聯合使用時能發揮協同效應,有望開發成新的抗真菌藥物。

烏拉爾甘草內生根瘤菌產生的環二肽化合物(圖3b),對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的MIC為250～500μg/mL[16]。苦丁茶內生芽胞桿菌產生的bacillomycin D(n-C14,iso-C15)(圖3c,d)對禾谷鐮刀菌等植物病原真菌有強烈抑制作用[17]。

1.4 甾體類

甾體類化合物廣泛存在于植物體內,植物內生菌寄生在植物組織中,其代謝產物中往往也含有甾體類化合物,以麥角甾烷型骨架居多[18]。

Gao等[19]從內生黃青霉中分離到2個甾體化合物penicisteroids A(圖4a)和anicequol(圖4b)。化合物(圖4a)為四羥基甾體,兩個化合物在濃度為20μg/disk時對黑曲霉和蕓苔鏈格孢菌的抑菌圈直徑介于6～18 mm。

從藥用植物烏頭中獲得一株內生擬莖點霉,由其發酵液中分離到2個新甾體化合物(14β,22E)-9,14-dihydroxyergosta-4,7,22-triene-3,6-dione(圖4c)、(5α, 6β,15β,22E)-6-ethoxy-5,15-dihydroxyergosta-7,22-dien-3-one(圖4d)和3個已知化合物calvasterols A(圖 4e)、calvasterols B(圖4f)及ganodermaside D(圖4g)。5個化合物對白色念珠菌、黑曲霉、稻瘟病菌、燕麥鐮刀菌、緊密著色芽生菌和毛癬菌具有抗菌活性[20]。

圖3 內生菌產生的具有抗菌活性的肽類化合物(a～g)Fig.3 Antimicrobial peptides(a-g)from endophytes

圖4 內生菌產生的具有抗菌活性的甾體類化合物(a～g)Fig.4 Antimicrobial sterides(a-g)from endophytes

1.5 醌類

天然醌類是具有對醌型或鄰醌型結構的一類化合物,以萘醌和蒽醌化合物居多[25]。

從Salsola oppostifolia中獲得的內生真菌Coniothyrium sp.能產生4個羥基蒽醌化合物(圖5g～j),均具有廣譜抗菌活性[21]。此外,從紅樹內生擬莖點霉中分離出1個新的四氫蒽醌衍生物(圖5k),對金黃色葡萄球菌和甲氧西林抗藥性葡萄球菌的MIC分別為128和64μg/mL[22]。

圖5 內生菌產生的具有抗菌活性的醌類化合物(a～k)Fig.5 Antimicrobial quinones(a-k)from endophytes

1.6 酚及酚酸類

內生菌代謝所產生的酚及酚酸類化合物通常具有抗菌活性。

芒果內生真菌Pestalotiopsis mangiferae產生的新化合物(圖6a)對枯草芽胞桿菌、肺炎克雷伯菌和大腸桿菌的MIC為0.039～5μg/mL[23]。垂絲海棠內生甘藍鏈格孢菌能產生3個廣譜抗菌化合物alternariol(圖6b)、alternariol 9-methyl ether(圖6c)和altechromone A (圖6d)[24]。Botryorhodines A和B(圖6e,f)來自內生真菌Botryosphaeria rhodina的代謝產物,這兩個化合物對多種植物病原真菌有抑制作用[25]。

Siddiqui等[26]從內生真菌Microdiplodia sp.中獲得3個新的酚類化合物(圖6g～i),3個化合物對嗜肺軍團菌和葡萄黑粉菌有抑菌活性。從植物Cistus monspeliensis中分離到一株內生真菌Phomopsis sp.,其產生的2個新的酚類化合物phomochromone A和B(圖6j,k)在濃度為1 mg/mL時,對大腸桿菌、巨大芽胞桿菌、灰霉菌和葡萄黑粉菌的抑菌圈半徑為5～8 mm[27]。

1.7 異香豆素衍生物

由元寶槭(Acer truncatum Bunge)葉子中獲得一株內生真菌Exserohilum sp.,該菌能產生2個新的異香豆素衍生物exserolides C和F(圖7a,b)和1個已知物(圖7c),其中化合物(圖7a)和(圖7c)抗真菌活性較好,化合物(圖7b)抗細菌效果顯著[28]。

Oliveira等[29]從內生真菌Xylaria sp.和Penicillium sp.的發酵液中獲得3個雙氫異香豆素(圖7d～f),其中一個(圖7d)為新化合物,對植物病原真菌C.cladosporioides、C.sphaerospermum的最小抑制量分別為10和25μg,另兩個化合物(圖7e,f)的最小抑制量為5～10μg。

從草本植物Fagonia cretica中獲得的內生真菌Microdochium bolley能產生3個新的異香豆素衍生物(圖7g～i)。在50μg/disk時,圖7g所示化合物對病原真菌Microbotryum violaceum的抑菌圈半徑為7 mm,圖7h和圖7i所示化合物對大腸桿菌、巨大芽胞桿菌和葡萄黑粉菌的抑菌圈半徑為6～9 mm[30]。

1.8 酯類

植物內生菌產生的天然酯類以內酯居多。

從野生地黃內生真菌Massrison sp.中分離到3個新的抗真菌酯類化合物：massarigenin D(圖8a)、spiromassaritone(圖8b)和paecilospirone(圖8c),化合物b的活性最強,對白色念珠菌、新型隱球菌、紅色毛癬菌和煙曲霉菌的MIC80為0.25～4μg/mL[31]。

圖6 內生菌產生的具有抗菌活性的酚類化合物(a～k)Fig.6 Antimicrobial phenols(a-k)from endophytes

圖7 內生菌產生的具有抗菌活性的醌類化合物(a～i)Fig.7 Antimicrobial quinones(a-i)from endophytes

印度楝內生真菌Phomopsis sp.能產生5個具有廣譜抗真菌活性的十環內酯化合物(圖8d～h)[32]。褐藻內生真菌產生的化合物(圖8i)對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等多種致病細菌的MIC介于6.25～100μg/m L[33]。

Pyrenocines J-M(圖8j～m)是從內生真菌Phomopsis sp.中獲得的新化合物,4個化合物均有很強的抗細菌活性[34]。此外,藤黃果內生蕈青霉能產生3個內酯化合物penicillone(圖8n)、pyrenocines A和B(圖8o,p),對M.gypseum的MIC分別為64、128和32μg/mL[35]。

圖8 內生菌產生的具有抗菌活性的酯類化合物(a～p)Fig.8 Antimicrobial esters(a-p)from endophytes

1.9 幾丁質酶

從玉米植物組織中分離到6株內生芽胞桿菌,其產生的幾丁質酶,對串珠鐮刀菌的防治率介于54.2%～79.6%[36]。花生內生放線菌能分泌3種幾丁質酶,分子量分別為80.8、78和76 k Da。3種酶對Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、Alternaria alternate等7種植物病原真菌均有抗菌活性[37]。此外,Lee等[38]從熱帶植物N.ampullaria和N.mirabilis中分離出26株內生菌,多數能產生具有抗菌活性的幾丁質酶。

1.10 葡聚糖酶

從盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensis)的根莖中分離到一株內生枯草芽胞桿菌SWB8,其產生的β-1,3和β-1,4-葡聚糖酶對金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌等9種病原菌有抗菌活性[39]。從蘆葦中分離出3株內生真菌Choiromyces aboriginum、Stachybotrys elegans和Cylindrocarpon sp.,其產生的外切-β-1,4-葡聚糖酶、內切-β-1,4-葡聚糖酶和β-1,3-葡聚糖酶對病原真菌Fusarium graminearum、Pythium aphanidermatum、Rhizoctonia cerealis、R.solani、Sclerotium rolfsii菌絲的生長有抑制作用[40]。

1.11 揮發性物質

Muscodor sutura是從Prestonia trifidi中分離到的一個新的內生菌屬,其產生的羅漢柏烯(圖9a)、chamigrene(圖9b)、異石竹烯(圖9c)等揮發性化合物對煙曲霉菌、灰霉菌、褐斑病菌等多種植物病原真菌有廣譜抗菌作用[41]。從裂欖木(Bursera simaruba)葉中分離到一株內生真菌Muscodor yucatanensis,其產生的辛烷、2-甲基丁基乙酸酯、2-戊基呋喃、石竹烯(圖9d)和香橙烯(圖9e)等揮發性化合物對Guignardia mangifera、Colletotrichum sp.、Phomopsis sp.有致死作用[42]。內生真菌Oxyporus latemarginatus分離自辣椒(Capsicum annum L.),其產生的揮發性化合物5-戊基-2-糠醛(圖9f)對鏈格孢菌、葡萄孢菌、炭疽病菌的抑制率介于13%～85%[43]。此外,齒舌蘭內生擬莖點霉能產生檜萜(圖9g)、苯乙醇、正丁醇和丙酮等揮發性抗菌成分[44]。

圖9 內生菌產生的具有抗菌活性的揮發性化合物(a～g)Fig.9 Antimicrobial volatile compounds(a-g) from endophytes

1.12 其他類

內生真菌Phomopsis sp.能產生4個新的具有抗菌活性的α-吡喃酮化合物phomopsinones A-D(圖10a～d)[45]。從白衫內生真菌Botryosphaeria dothidea KJ-1中獲得3個新化合物(圖10e～g),對大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌有抗菌活性[46]。

Cryptosporioptide(圖10h)是從內生真菌Cryptosporiopsis sp.中獲得的一個聚酮類化合物,在50μg/disk時對B.megaterium的抑菌圈半徑為9 mm[47]。從葡萄葉中獲得的內生菌Acremonium byssoides能產生4個新化合物acremines H,I,L, N(圖10i～l),在濃度為1 mmol/L時,對Plasmopara viticola孢子萌發的抑制率為30.4%～69.4%[48]。

Senadeera等[49]從內生真菌Dothideomycete sp.中分離到1個新的聚酮化合物(圖10m),該化合物對甲氧西林抗藥性金黃色葡萄球菌有明顯抑菌活性。此外,印度楝內生真菌Nigrospora sp.能夠產生2個solanapyrone同系物solanapyrones N和O(圖10n,o),對黑曲霉、葡萄孢菌和島青霉的MIC介于31.25～250μg/mL[50]。

圖10 內生菌產生的具有抗菌活性的其他類化合物(a～o)Fig.10 Other antimicrobial compounds(a-o)from endophytes

2 植物內生菌在果蔬采后保鮮中的應用

水果蔬菜營養豐富,但其在采后儲藏過程中易受到病原菌感染而腐爛。據統計,在發達國家因采后病害導致的果蔬腐爛達20%～25%,而我國的果蔬損失率高達25%～30%[5152]。目前,果蔬在儲藏過程中多采用化學殺菌劑進行采后病害的防治[53],然而化學殺菌劑的長期使用導致病原菌產生抗藥性,且農藥殘留嚴重威脅著人類健康。植物內生菌作為重要的生防微生物,可通過接種內生菌菌體或其產生的抗菌物質等方式發揮防病功效[54],減輕或消除化學殺菌劑帶來的不良影響。

2.1 植物內生菌菌體防治保鮮

Lai等[55]從山豆根(Sophora tonkinensis)中分離到一株內生多黏類芽胞桿菌,該菌對Penicillium digitatum引起的柑橘類水果采后綠霉病有較好的防治效果。當該菌的接種量達到1×109cfu/mL時,綠霉病的發病率降低到18.3%,且接種后水果的緊實度、可溶性固形物、維生素C含量以及可滴定酸度等生理指標未發生改變。Shi等[56]研究了內生細菌惡臭假單胞菌的變種MGP1對木瓜炭疽病的防治效果,發現MGP1對木瓜炭疽病的最大防治率達63%。此外, Shi等[57]進一步研究了木瓜炭疽病與木瓜內生細菌惡臭假單胞菌MGY2的互作效應,發現MGY2處理后木瓜的發病率和病變直徑顯著降低,且MGY2能通過提高木瓜苯丙氨酸氨裂解酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等抗病相關酶的活性和基因表達量以及總酚含量等方式增強宿主的抗病性。Wang等[58]研究了內生枯草芽胞桿菌EB-28對西紅柿腐爛致病菌灰霉病菌的防治效果,發現EB-28對灰霉病的防治效果顯著,其體外和體內防治率分別為71.1%和52.4%。

2.2 植物內生菌產生的抗菌物質防治保鮮

Nodulisporium spp.是從Lagerstroemia loudoni分離到的一株內生真菌,該菌能產生31種揮發性化合物。其發酵液對檸檬綠霉病、來蒙青霉病和柑橘青霉病的防治效果顯著,最低防治濃度分別為50、60和60 g[59]。從辣椒(Capsicum annum L.)中獲得一株內生真菌Oxyporus latemarginatus,其固體發酵產物能有效防治葡萄孢菌引起的蘋果采后腐爛,采用50 g固體發酵產物處理后,蘋果的防治率達98.4%,其產生的主要抗菌活性物質為5-戊基-2-糠醛(134)[43]。從越南肉桂(Cinnamomum loureirii)中獲得的內生真菌Nodulisporium sp.能產生欖香烯、1-甲基-1,4-環己二烯、芹子烯和α-芹子烯等揮發性成分,對B. cinerea引起的蘋果灰霉病和P.expansum引起的蘋果青霉病均有很好的防治效果[60]。此外,黃海東等[61]從云霧龍膽中分離到一株內生短小芽胞桿菌LD-b1,其發酵液對蘋果腐爛病菌病斑直徑僅為對照的13.7%。

3 結語與展望

自從Stierle等[62]首次從內生菌Pestalotiopsis microspore代謝產物中分離出抗癌物質紫杉酚以來,從內生菌次級代謝產物中尋找新型天然藥物引起了人們的廣泛關注。越來越多的研究表明,植物內生菌能夠產生種類豐富的天然活性物質,這些物質大多具有抗菌活性[46]。因此植物內生菌產生的次級代謝產物為解決日益突出的病原菌耐藥性,開發高效、低毒、環保的抗菌藥物開辟了一條新途徑。植物內生菌作為一個天然抗菌活性物質庫,其研究潛力巨大。目前對于內生菌的研究尚處于初級階段,許多問題有待解決[63]。除繼續從傳統植物內生菌中尋找新的抗菌活性物質外,從特殊生境條件下的內生菌中篩選抗菌物質越來越受到青睞[18]。目前對于內生菌的研究還僅局限于可培養內生菌,然而有些內生菌在人工培養基中無法生長,因此限制了活性物質的篩選[1]。如何利用現代技術手段最大程度的模擬宿主環境,從而篩選更多的內生菌及其活性產物成為當前面臨的一大難題[64]。植物內生菌與宿主植物在長期進化過程中形成了共生關系,植物內生菌能產生與宿主植物相同的代謝產物[65],然而其代謝產物是如何進行調控,內生菌與宿主之間如何進行信號傳遞和基因交流目前尚不清楚。

植物內生菌活性產物種類繁多,然而許多活性產物尤其是新型未知的功能成分由于其含量太低,當前的技術手段無法檢測,從而制約了新型藥物的發現。內生菌代謝產物受培養條件的影響較大,如何優化內生菌培養條件,獲得高產菌株以實現工業化生產仍需繼續探索。當前,有關內生菌活性產物構效關系的研究相對較少,有些產物的抗菌活性較低或毒性較高,因此有必要對其進行結構修飾,以增強或降低其生物活性,使其更好地服務于人類和生態環境。

植物內生菌易受外界環境影響,將其用于果蔬采后病害防治時,其防治效果是否穩定,是否會引起果蔬生理發生變化,是否會產生有害成分仍需進一步研究。此外,采用內生菌活性物質進行果蔬采后防治時,由于其發酵周期長、活性成分含量低以及現代分離純化技術尚不成熟等因素的制約,其生物防治劑多處于研發階段,成果轉化和應用率較低[66]。

我國幅員遼闊,植物資源豐富,因此有眾多植物內生菌資源有待開發,尤其是對海洋植物以及處于特殊生境條件下的植物內生菌的研究較少。但生命科學以及現代分析檢測技術的不斷發展,必將加速推進植物內生菌抗菌活性物質的篩選步伐。

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(責任編輯：田 喆)

Progress in antimicrobial products from endophytes and their application in the preservation of postharvest fruits and vegetables

Zhou Jinwei1, Zhou Hongli1, Bai Lianyang2, Yi Youjin1, Li Gaoyang3, Xia Bo1, Long Lilin1

(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology/College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;3.Institute of Agro-product Processing Science and Technology, Hunan Provincial Academy of Agricultural Sciences,Changsha 410128,China)

Endophytes are microorganisms residing in the tissues of living plants which are relatively unstudied for a long time.However,more and more researches have proven that endophyte are precious sources of novel antimicrobial products.Presently a number of antimicrobial natural products belong to diverse structural classes have been isolated from endophytes.This review summarizes the antimicrobial products produced by endophytes and their antimicrobial effects.Besides,the application of endophytes in post-harvest fruits and vegetables is briefly discussed.The prospects and existing problems of isolating natural products from endophytes are also discussed.

endophytes; antimicrobial products; antimicrobial activity; fruits and vegetables;postharvest preservation

S 476.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.004

2014-12-05

2014-12-29

國家科技支撐計劃項目(2015BAD16B00,2015BAD16B01);國家自然科學基金項目(31071738,31000827);長沙市科技局項目(K1308044-21);湖南省研究生科研創新項目(CX2013B310);湖南省自然科學基金項目(09JJ3032)

*通信作者 E-mail：yiyoujin@126.com