土壤強還原過程產生的有機酸對土傳病原菌的抑制作用

黃新琦, 溫 騰, 孟 磊, 張金波, 蔡祖聰*

(1.南京師范大學地理科學學院,南京 210023;2.江蘇省物質循環與污染控制重點實驗室,南京 210023;3.海南大學農學院,?？?570228)

土壤強還原過程產生的有機酸對土傳病原菌的抑制作用

黃新琦1,2, 溫 騰1, 孟 磊3, 張金波1,2, 蔡祖聰1,2*

(1.南京師范大學地理科學學院,南京 210023;2.江蘇省物質循環與污染控制重點實驗室,南京 210023;3.海南大學農學院,?？?570228)

土壤強還原(reductive soil disinfestation,RSD)能有效殺滅土傳病原菌,并已在日本、荷蘭和美國取得一系列的推廣應用,但對于RSD的殺菌機理不甚明了。本試驗采用高效液相色譜和熒光定量PCR等技術研究了以玉米秸稈為有機碳源的RSD處理過程中土壤產生的有機酸種類,以及不同濃度的有機酸對土壤病原菌的抑制效果。結果表明：以玉米秸稈為有機碳源的RSD過程中主要產生了乙酸和丁酸;經50 mmol/L丁酸溶液處理的土壤中立枯絲核菌、辣椒疫霉、尖孢鐮刀菌及茄勞爾氏菌的數量分別為對照的3.5%、38.9%、11.5%和7.9%;10 mmol/L的丁酸可以完全抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長;5 mmol/L的丁酸即可完全抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發。本研究結合前人報道表明有機酸,尤其是乙酸和丁酸,對于RSD的殺菌機理起著重要的作用。

土傳病害; 乙酸; 丁酸; 尖孢鐮刀菌

土傳病害是指由存在于土壤中的病原微生物在條件適宜時萌發并侵染植物而導致的病害[1]。大量的研究表明,在環境條件相對不變的條件下,隨著土壤病原菌數量的增加,作物土傳病害的發生呈上升趨勢[2-3]。因此,能否有效地降低土壤中病原菌的數量是防控土傳病害取得成功的關鍵因素。目前生產上主要通過使用化學殺菌劑[4]以及一些物理的土壤消毒方法,如暴曬、深翻、淹水等[5],來降低病土中植物病原菌的數量。但由于人們日益增加的食品安全顧慮,許多化學殺菌劑已不再被允許使用;傳統土壤消毒方法也由于成本較高、防治效果差或者環保上的原因不能進行推廣[6]。因此,迫切需要尋找替代的土壤消毒方法來降低連作土壤中植物病原菌的數量。

在2000年,日本和荷蘭相繼獨立發明了土壤強還原法(reductive soil disinfestation,RSD)來降低土壤中病原菌數量及防控作物土傳病害[78]。RSD由向土壤中添加易分解的有機物料并保持土壤厭氧狀態組成。盡管此方法在日本、荷蘭和美國進行了一系列的推廣應用[9],但人們對于RSD的殺菌機理仍不甚明了[10]。許多研究表明RSD過程中產生的有機酸,尤其是乙酸和丁酸,可能起到殺菌的效果[10],本試驗在此基礎上研究了RSD過程中是否能產生除乙酸和丁酸之外的抑菌有機酸,以及這些有機酸的不同濃度對于多種土壤病原微生物的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤：試驗土壤采自江蘇省宜興市多年種植水稻地塊,采回后經暴曬、風干和過篩后備用。供試有機物料：收集采摘后的玉米秸稈地上部,充分晾干,打碎,C/N為45.7。

供試菌株：尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium ox ysporum f.sp.cubense)N21菌株由本實驗室分離純化;立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)Q1、茄勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)2010、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)MXL1由南京農業大學資源與環境學院提供。

選擇性培養基：尖孢鐮刀菌選擇性培養基(K2培養基)[11]：K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4· 7H2O 0.5 g、Fe-Na-EDTA 0.01 g、L-天門冬酰胺2 g、半乳糖10 g、瓊脂16 g,去離子水定容至900 m L,高壓滅菌后冷卻至60℃,加入100 m L鹽溶液(75%五氯硝基苯0.9 g、牛膽鹽0.45 g、Na2B4O7· 10 H2O 0.5 g、硫酸鏈霉素0.3 g,用10%磷酸調p H至3.8±0.2)。M-SMSA培養基[12]：水解酪蛋白1 g,蛋白胨10 g,甘油5 m L,瓊脂20 g,蒸餾水1 L。p H 6.5,121℃高壓滅菌15 min,冷卻至50℃每升加入以下成分：結晶紫5 mg、多黏菌素B硫酸鹽100 mg、桿菌肽25 mg、氯霉素5 mg、青霉素5 mg、2,3,5-三苯基四氮50 mg、放線菌酮100 mg。燕麥培養基[13]：燕麥片30 g,煮沸30 min后過濾去除雜質,瓊脂20 g,蒸餾水補足至1 000 m L,121℃高壓滅菌20 min,冷卻后加入利福平20 mg、氨芐青霉素200 mg、70%五氯硝基苯100 mg。

1.2 病原菌的制備

按文獻報道[14],將真菌性病原菌(尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和辣椒疫霉)活化后轉接到裝有100 m L馬鈴薯蔗糖培養基的500 m L三角瓶中,靜置培養7 d,取出洗凈后放入均質儀中打碎。將細菌性病原菌(茄勞爾氏菌)活化后轉接至牛肉膏蛋白胨培養基中,30℃170 r/min振蕩培養2 d,將菌懸液7 000 g離心10 min,棄去上清,將菌體重懸于0.5%的生理鹽水中。最終將真菌性病原菌以1 kg土1.5 g菌絲鮮重的濃度、細菌性病原菌以1 g土106cfu的濃度均勻拌入上述準備好的水稻土中。

1.3 抑菌有機酸的篩選

根據文獻報道[15],選擇乙酸、丁酸、順丁烯二酸、異戊酸、乳酸、檸檬酸、丙酸和蟻酸這8種有機酸進行篩選試驗。將50 m L濃度為50 mmol/L的有機酸溶液倒入裝有50 g病土的250 m L三角瓶中,封口后將三角瓶放置在25℃的培養箱中培養5 d,分別以加5 m L和50 m L去離子水的裝有相等土量的三角瓶為好氧(CK1)和厭氧(CK2)對照,每個處理3個重復。培養結束后采用K2培養基對土壤中的尖孢鐮刀菌進行平板涂布計數。

1.4 RSD過程中產有機酸種類的鑒定

將150 g拌有玉米秸稈(1%,W/W)的病土裝入圓柱形的容器(內徑5 cm,高15 cm)中,然后加入75 mL去離子水,末端密封,將土柱置于25℃的培養箱中培養10 d。以未混有玉米秸稈的病土為對照,每個處理3個重復。培養結束后,用土壤溶液采樣器采集土壤溶液,過0.45μm濾膜后4℃保存備用。

使用高效液相色譜(HPLC)測定土壤溶液中的有機酸。HPLC采用XDB-C18柱(4.6×250 mm, Agilent,USA),并以2.5 mmol/L H2SO4(A)和甲醇(B)為流動相。梯度洗脫步驟為：0 min,95%A +5%B;5 min,95%A+5%B;8 min,85%A+ 15%;40 min,85%A+15%B。流速為1 m L/min,紫外檢測波長為210 nm。

1.5 不同濃度有機酸對病原菌數量的抑制試驗

將50 mL不同濃度的有機酸溶液加入裝有50 g病土的250 m L三角瓶中,置于25℃的培養箱中培養5 d,以去離子水作為對照,每個處理3個重復。培養結束后通過平板稀釋涂布計數法檢測土壤中茄勞爾氏菌(M-SMSA培養基)和辣椒疫霉(燕麥培養基)的數量。采用熒光定量PCR檢測立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的數量,土壤DNA的提取采用Power-Soil?DNA提取試劑盒(MO-BIO,美國),熒光定量PCR反應體系和反應條件參照文獻[14,16],立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的特異性引物分別為ST-RS1(F) 5'-AGTGTTATGCTTGGTTCCACT-3',ITS4(R)5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和ITS1-F(F)5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3',AFP308(R) 5'-CGAATTAACGCGAGTCCCAAC-3'。

1.6 有機酸對尖孢鐮刀菌孢子萌發和菌絲生長的影響

將活化后的尖孢鐮刀菌菌絲塊(直徑5 mm)轉接至含稀釋4倍的馬鈴薯蔗糖培養基(potato dextrose agar,PDA)的平板中間,25℃培養1 d,然后在距菌絲中心3 cm的位置放置牛津杯,在牛津杯里加入100 mmol/L有機酸,25℃再培養2 d后觀察菌落形態。1/4 PDA培養基熔化冷卻后加入過濾除菌的有機酸,混合均勻倒平板,制備含不同濃度不同種類有機酸的1/4 PDA平板,將活化后的尖孢鐮刀菌菌絲塊轉接至上述1/4 PDA平板中間,25℃培養3 d后測定菌落直徑。參照文獻[17]制備尖孢鐮刀菌孢子懸浮液,使其濃度為每毫升小于1 000個孢子。在含有不同濃度有機酸的2%水瓊脂平板上涂布0.1 m L上述孢子懸浮液,平板置于培養箱中25℃培養3 d,統計平板上萌發的孢子數。

1.7 數據處理

試驗數據處理使用Excel 2003和SPSS 13.0 (SPSS Inc.,Chicago,USA)統計分析軟件。

2 結果與分析

2.1 抑制尖孢鐮刀菌有機酸的篩選

本研究參照文獻報道選擇了RSD過程中可能產生的8種有機酸,檢測其對土壤中尖孢鐮刀菌數量的影響。結果表明(圖1)：乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸能顯著降低土壤中尖孢鐮刀菌的數量,其中異戊酸對病原菌的抑制作用最強,加入50 mmol/L異戊酸溶液的土壤中尖孢鐮刀菌數量僅為對照(CK2)的7.4%;乙酸和丁酸次之,加入50 mmol/L乙酸和丁酸溶液的土壤中尖孢鐮刀菌數量分別為對照(CK2)的16.2%和11.5%;丙酸的抑制作用最弱。相較而言,另4種有機酸對于尖孢鐮刀菌并無抑制作用,與CK2相比,加入順丁烯二酸、乳酸、檸檬酸和蟻酸溶液的土壤中尖孢鐮刀菌數量反而顯著增加。

圖1 土壤中添加50 mmol/L不同種類有機酸處理5 d后的尖孢鐮刀菌數量Fig.1 The population of Fusarium oxysporum in the soil after treated with 50 mmol/L different organic acids solutions for 5 days

2.2 RSD過程中產生有機酸種類的鑒定

土壤溶液HPLC測定結果(圖2)表明,添加1%玉米秸稈并持續淹水10 d的土壤中產生了大量的乙酸和丁酸,此外還有少量的丙酸,而并未檢測到異戊酸。在只淹水未添加有機物料的土壤溶液中沒有檢測到有機酸。

圖2 HPLC測定RSD處理的土壤溶液中的有機酸種類圖譜Fig.2 Identification of organic acids in the soil treated by RSD using HPLC

2.3 有機酸對于土壤中病原菌數量的影響

不同濃度的4種抑菌有機酸對病原菌數量影響試驗結果(圖3)表明：4種有機酸都能顯著降低土壤中立枯絲核菌、辣椒疫霉、尖孢鐮刀菌及茄勞爾氏菌的數量(P＜0.05),其中,立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌及茄勞爾氏菌數量降幅較大。在這4種有機酸中,異戊酸對于病原菌的抑制作用最強,乙酸和丁酸次之,丙酸最弱;并且隨著有機酸濃度的增加,對病原菌的抑制作用呈上升趨勢。加入50 mmol/L異戊酸溶液的土壤中立枯絲核菌、辣椒疫霉、尖孢鐮刀菌及茄勞爾氏菌的數量分別為對照(添加去離子水的病土)的3.1%、25.7%、5.2%和4.4%;加入50 mmol/L丁酸溶液的土壤中立枯絲核菌、辣椒疫霉、尖孢鐮刀菌及茄勞爾氏菌的數量分別為對照的3.5%、38.9%、11.5%和7.9%。

圖3 經不同濃度4種有機酸溶液處理后土壤中不同植物病原菌數量的變化Fig.3 Change of the populations of different plant pathogens in the soils treated with four kinds of toxic organic acid solutions with different concentrations

2.4 有機酸對尖孢鐮刀菌孢子萌發和菌絲生長的影響

如圖4所示,4種有機酸均能顯著抑制尖孢鐮刀菌的菌絲生長和孢子萌發,并且抑制作用隨著有機酸濃度的增加而增強。其中丁酸和異戊酸對尖孢鐮刀菌的抑制作用較強;10 mmol/L的丁酸和異戊酸可以完全抑制尖孢鐮刀菌的菌絲生長;5 mmol/L丁酸和異戊酸即可完全抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發。

圖4 含有不同濃度4種有機酸的1/4 PDA培養基對尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發的影響Fig.4 Influences of 1/4 PDA medium with different concentrations of the four toxic organic acids on the mycelium growth and the spore germination of Fusarium oxysporum

此外,在牛津杯試驗中(圖5)可以明顯觀察到4種有機酸抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長而使其形成橢圓形的菌落。

圖5 牛津杯試驗測定不同種類有機酸(100 mmol/L)對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制作用Fig.5 Determination of the inhibitory effect of different organic acids(100 mmol/L)on the growth of Fusarium oxysporum mycelia using Oxford cups

3 討論

RSD已被許多研究證實是一種可以降低土壤病原真菌及線蟲數量的有效技術[910,18]。隨后許多研究結果,如RSD處理過程中土壤p H下降及有機酸產生菌,如梭菌屬(Clostridium spp.)的出現等,表明RSD過程中產生的有機酸可能是RSD具有殺菌效果的重要原因[19]。這些有機酸可能有乙酸、丁酸、順丁烯二酸、異戊酸、乳酸、檸檬酸、丙酸和蟻酸[15]。本試驗結果表明,乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸可以顯著降低土壤病原菌數量。隨后對RSD過程中土壤溶液的HPLC測定結果表明,以玉米秸稈為有機碳源的RSD處理過程中產生了大量的乙酸和丁酸,此外還有少量的丙酸。Momma等在以乙醇為有機碳源的RSD中檢測到了大量的乙酸[20],還有報道指出以麥麩或葡萄糖為碳源的RSD處理的土壤中產生了乙酸和丁酸[19,21]。這些研究表明了不論是何種有機物料,乙酸和丁酸是RSD處理過程中產生的主要抑菌有機酸。此外,順丁烯二酸、乳酸、檸檬酸和蟻酸顯著增加了土壤中病原菌數量,原因可能是這4種有機酸為病原菌提供了營養,促進了病原菌的生長。

Goud等使用RSD法防控大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的梓樹黃萎病[22],Messiha等使用RSD法防控茄勞爾氏菌引起的土豆青枯病[23],Yossen等使用RSD法防控尖孢鐮刀菌引起的康乃馨枯萎病[24],這些研究表明RSD是一種廣譜性的殺滅土壤病原菌進而防控土傳病害的有效方法。本研究結果同樣表明,RSD過程中產生的有機酸對多種土傳病原菌(茄勞爾氏菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉)具有殺滅效果,50 mmol/L的乙酸和丁酸處理過的土壤中這4種病原菌的數量分別為對照的5.9%、3.5%、11.7%、33.9%和7.9%、3.6%、11.5%、38.9%。Momma等報道指出在以乙醇為有機碳源的RSD處理土壤中可以產生約3 000 mg/L(50 mmol/ L)的乙酸,在以麥麩為有機碳源的RSD處理土壤中可以產生約2 000 mg/L(33 mmol/L)的乙酸和1 700 mg/L(19 mmol/L)的丁酸[1920],這些報道結合本研究結果表明,RSD過程中產生的有機酸對于RSD的殺菌效果起著重要的作用。此外,較低濃度的有機酸也可對病原菌起抑制作用,如10 mmol/L的丁酸可以完全抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長;5 mmol/L的丁酸能夠不可逆地抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發,此結果與前人報道相似,即經約10 mmol/L的丁酸溶液處理后的尖孢鐮刀菌分生孢子不能復蘇[19]。本研究豐富了RSD的殺菌機理,明確了RSD過程中產生的主要有機酸的種類及不同濃度的有機酸對土壤病原微生物的抑制效果,盡管如此,我們并不能排除RSD過程中還產生了除有機酸以外的殺菌物質的可能性,如鐵錳離子、氨氣和硫化氫[15]等,還有待進一步研究。

[1] 李世東,繆作清,高衛東.我國農林園藝作物土傳病害發生和防治現狀及對策分析[J].中國生物防治學報,2011,27(4)：433-440.

[2] 何欣,黃啟為,楊興明,等.香蕉枯萎病致病菌篩選及致病菌濃度對香蕉枯萎病的影響[J].中國農業科學,2010,43(18)：3809-3816.

[3] Chinn S H F,Sallans B J,Ledingham R J.Spore populations of Helminthosporium sativum in soils in relation to the occurrence of common rootrot of wheat[J].Canadian Journal of Plant Science,1962,42(4)：720-727.

[4] Oka Y.Mechanisms of nematode suppression by organic soil amendments—A review[J].Applied Soil Ecology,2010,44 (2)：101-115.

[5] Katan J.Physical and cultural methods for the management of soilborne pathogens[J].Crop Protection,2000,19(8/10)：725-731.

[6] Li Weiming,Qian Chenmei,Mo Yiwei,et al.Tolerance of banana for Fusarium wilt is associated with early H2O2accumulation in the roots[J].African Journal of Biotechnology, 2011,10(55)：11378-11387.

[7] Blok W J,Lamers J G,Termorshuizen A J,et al.Control of soilborne plant pathogens by incorporating fresh organic amendments followed by tarping[J].Phytopathology,2000, 90(3)：253-259.

[8] Shinmura A.Causal agent and control of root rot of welsh onion [C].PSJ Soilborne Disease Workshop Report,2000,20：133-143.

[9] Butler D M,Kokalis-Burelle N,Muramoto J,et al.Impact of anaerobic soil disinfestation combined with soil solarization on plant-parasitic nematodes and introduced inoculum of soilborne plant pathogens in raised-bed vegetable production[J].Crop Protection,2012,39：33-40.

[10]Momma N,Kobara Y,Uematsu S,et al.Development of biological soil disinfestations in Japan[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(9)：3801-3809.

[11]Sun E J,Su H J,Ko W H.Identification of Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 4 from soil or host tissue by cultural characters[J].Phytopathology,1978,68(11)：1672-1673.

[12]French E R,Gutarra L,Aley P,et al.Culture media for Ralstonia solanacearum isolation,identification and maintenance [J].Fitopatolgia,1995,30(3)：126-130.

[13]朱桂寧,黃福新,秦碧霞,等.致病疫霉的分離培養和單孢純化方法[J].中國蔬菜,2003(6)：41-42.

[14]Huang Xingqi,Zhang Nan,Yong Xiaoyu,et al.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off disease in cucumber with Bacillus pumilus SQR-N43[J].Microbiological Research,2012, 167(3)：135-143.

[15]Runia W T,Molendijk L P G.Physical methods for soil disinfestation in intensive agriculture：Old methods and new approaches[J].Acta Horticulturae,2010,883：249-258.

[16]趙爽,羅佳,凌寧,等.基因宏陣列和熒光定量PCR方法對西瓜枯萎病害土壤中尖孢鐮刀菌的快速檢測和定量[J].土壤學報,2010,47(4)：703-708.

[17]Ling Ning,Huang Qiwei,Guo Shiwei,et al.Paenibacillus polymyxa SQR-21 systemically affects root exudates of watermelon to decrease the conidial germination of Fusarium oxysporum f.sp.niveum[J].Plant and Soil 2011,341(1/2)：485-493.

[18]Katase M,Kubo C,Ushio S,et al.Nematicidal activity of volatile fatty acids generated from wheat bran in reductive soil disinfestation[J].Nematology Reasearch,2009,39(2)：53-62.

[19]Momma N,Yamamoto K,Simandi P,et al.Role of organic acids in the mechanisms of biological soil disinfestation(BSD) [J].Journal of General Plant Pathology,2006,72(4)：247-252.

[20]Momma N,Kobara Y,Momma M.Fe2+and Mn2+,potential agents to induce suppression of Fusarium oxysporum for biological soil disinfestation[J].Journal of General Plant Pathology,2011,77 (6)：331-335.

[21]Okazaki H,Nose K.Acetic acid and n-butyric acid as causal agents of fungicidal activity of glucose-amended flooded soil[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan,1986,52 (3)：384-393.

[22]Goud J K C,Termorshuizen A J,Blok W J,et al.Long-term effect of biological soil disinfestation on Verticillium wilt[J]. Plant Disease,2004,88(7)：688-694.

[23]Messiha N A S,van Diepeningen A D,Wenneker M,et al.Biological Soil Disinfestation(BSD),a new control method for potato brown rot,caused by Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2[J].European Journal of Plant Pathology,2007,117 (4)：403-415.

[24]Yossen V,Zumelzu G,Gasoni L,et al.Effect of soil reductive sterilisation on Fusarium wilt in greenhouse carnation in Córdoba,Argentina[J].Australasian Plant Pathology,2008, 37(5)：520-522.

(責任編輯：田 喆)

Inhibitory effects of organic acids produced in reductive soil disinfestation on soil-borne plant pathogens

Huang Xinqi1,2, Wen Teng1, Meng Lei3, Zhang Jinbo1,2, Cai Zucong1,2

(1.School of Geography Science,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China; 2.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Materials Cycling and Pollution Control,Nanjing 210023,China; 3.College of Agriculture,Hainan University,Haikou 570228,China)

Reductive soil disinfestation(RSD)is an effective way to suppress soil-borne plant pathogens.Although it is increasingly used in USA,Netherlands and Japan,its precise mechanism has not been well elucidated so far. High performance liquid chromatography and quantitative real-time PCR were used for investigating the organic acids produced in maize straw amended RSD and the inhibitory effect of organic acids on the soilborne pathogens in this work.The results showed that acetic acid and butyric acid were the primary compounds produced in maize straw amended RSD.The populations of Rhizoctonia solani,Phytophthora capsici,Fusarium oxysporum and Ralstonia solanacearum in the diseased soil treated by 50 mmol/L butyric acid solution decreased by 96.5%,61.1%, 88.5%and 82.1%,respectively,compared with those in non-treated diseased soil.The growth of F.oxysporum mycelium was completely stopped in 1/4 potato dextrose agar medium containing 5 mmol/L butyric acid,and 5 mmol/L butyric acid could entirely inhibit the germination of F.oxysporum spores.This work together with previous reports indicated that organic acids,especially acetic and butyric acid,played an important role in the mechanism of RSD.

soil-borne disease; acetic acid; butyric acid; Fusarium oxysporum

S 432.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.006

2014-09-05

201411-04

國家自然科學基金項目(41301335);高等學校博士學科點專項科研基金(20133207120018);中國博士后科學基金(2014M551622);江蘇高校優勢學科建設工程

*通信作者 E-mail：zccai@njnu.edu.cn