瀘州煙草黑脛病病原生理小種組成及對甲霜靈和烯酰嗎啉的敏感性

戰徊旭, 溫娜娜, 羅定棋, 夏建華, 徐傳濤, 張成省*

(1.中國農業科學院煙草研究所,青島 266101;2.四川省煙草公司瀘州市公司,瀘州 646000)

瀘州煙草黑脛病病原生理小種組成及對甲霜靈和烯酰嗎啉的敏感性

戰徊旭1, 溫娜娜1, 羅定棋2, 夏建華2, 徐傳濤2, 張成省1*

(1.中國農業科學院煙草研究所,青島 266101;2.四川省煙草公司瀘州市公司,瀘州 646000)

煙草黑脛病(Phytophthora nicotianae)是四川省瀘州煙區最為嚴重的病害之一,為明確瀘州煙草黑脛病生理小種組成及其對甲霜靈和烯酰嗎啉的敏感性,從瀘州主產煙區采集樣品,分離得到24株煙草黑脛病菌株;通過鑒別寄主法結合TTZ生化反應,發現24株菌株中,0號生理小種15株,占62.50%,1號生理小種9株,占37.50%。對24株菌株進行甲霜靈和烯酰嗎啉的藥劑敏感性檢測,發現甲霜靈對24株菌株的EC50范圍在0.052～0.513μg/mL之間,敏感菌株和中抗菌株分別占41.67%和58.33%,未發現高抗菌株;烯酰嗎啉對24株菌株的EC50范圍在0.110～1.615μg/m L之間,敏感菌株和中抗菌株分別占37.50%和62.50%,未發現高抗菌株。上述結果表明,瀘州煙區煙草黑脛病菌同時存在0號生理小種和1號小種,而且該煙區的黑脛病菌已對甲霜靈和烯酰嗎啉產生不同程度的抗性。

煙草黑脛病; 生理小種; 藥劑敏感性; 甲霜靈; 烯酰嗎啉

目前,煙草黑脛病的主要防治方法有種植抗病品種、栽培措施、化學防治和生物防治,其中化學防治是綜合防治措施中的重要手段[8]。隨著化學藥劑的普遍使用,煙草疫霉的抗藥性問題日益凸顯。甲霜靈和烯酰嗎啉是生產上常用的兩種煙草黑脛病防治藥劑,研究人員發現甲霜靈在超過20年的連續使用后,煙草疫霉抗性菌株已在美國、西班牙和南非陸續出現[9-11]。1994年Albert檢測到了葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉的抗性菌株,也證實了烯酰嗎啉抗藥性風險的存在[12]。四川省煙草黑脛病菌對于甲霜靈和烯酰嗎啉的敏感性測定結果尚未見報道,因此,本文在明確瀘州煙區煙草黑脛病菌生理小種組成和分布的基礎上,檢測它們對甲霜靈和烯酰嗎啉的敏感性,摸清瀘州煙區抗性菌株的分布及抗藥性水平,以期為煙草黑脛病的藥劑防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：自2010年6月至2011年9月,從瀘州煙區古藺、敘永兩個產煙縣的主要產煙鄉鎮采集具有典型癥狀的煙草黑脛病病株,帶回實驗室進行分離鑒定。

供試藥劑：95%甲霜靈原藥由江蘇寶靈化工股份有限公司提供。96%烯酰嗎啉原藥由巴斯夫歐洲公司提供。

根據文獻分別配制燕麥培養基、TTZ液體培養基和TTZ固體培養基[1315]。

甲霜靈固體培養基：甲霜靈原藥先用丙酮溶解,再用無菌水分別配成0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L,使各濃度甲霜靈溶液中所含丙酮的量一致,然后經0.22μm細菌過濾器除菌,再分別加入熔化后冷卻至40℃左右的燕麥培養基中,即制成不同濃度的甲霜靈固體培養基。

烯酰嗎啉固體培養基：烯酰嗎啉原藥先用丙酮溶解,再用無菌水配成0、0.05、0.10、0.25、0.50、2.00 mg/L,并使各濃度中所含丙酮的量一致,然后經0.22μm細菌過濾器除菌,再分別加入熔化后冷卻至40℃左右的燕麥培養基中,即制成不同濃度的烯酰嗎啉固體培養基。

鑒別寄主：選擇反應相對穩定且能鑒定出0號、1號、2號和3號生理小種的3個煙草品種‘NC1071’、‘Nicotiana nesophila’和‘Florida301’作為鑒別寄主,‘小黃金1025’為感病對照。以上煙草品種皆由中國煙草總公司青州煙草研究所提供。煙草黑脛病菌4個生理小種在各鑒別寄主上的反應見表1。

表1 煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應1)Table 1 Reaction of Phytophthora nicotianae on different hosts

1.2 方法

1.2.1 病原分離

取典型的煙草黑脛病病株,將新鮮病組織表面用蒸餾水沖洗干凈,超凈工作臺內晾干,切取莖基部病健交界處組織5 mm×5 mm小塊,在75%乙醇中消毒1 min,0.1%升汞消毒1 min,而后用滅菌水清洗3次,每次2～3 min。表面消毒后,取出組織用滅菌濾紙將其表面水分吸干,置于選擇性燕麥瓊脂培養基平板上培養,每皿均勻放置3～4塊,28℃光照培養箱中培養,2～4 d后挑取邊緣菌落純化。

1.2.2 TTZ顏色反應

供試煙草黑脛病菌在28℃恒溫培養箱內培養3～5 d,用直徑為5 mm的打孔器取邊緣菌齡一致的菌塊,移入TTZ固體培養基和液體培養基中,以不加TTZ(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)的基礎培養基為對照,每處理設3個重復。28℃條件下培養24 h后,觀察固體培養基及菌體的顏色變化,培養72 h后,觀察液體培養基及菌體的顏色變化。

判斷依據：0號和1號生理小種在TTZ液體培養基中,72 h內菌絲全部變為紅色;在固體培養基中,24 h菌體變為紅色;3號生理小種在TTZ液體培養基和固體培養基中均不變色[14]。

1.2.3 接種

首先按照文獻[20]中方法制備游動孢子懸浮液,然后用5號針頭大小的醫用注射器吸取制備好的游動孢子懸浮液,在6～8葉期煙苗莖基部以上1 cm處注射,每株0.5 m L。每處理4次重復,每重復3株。接種后的煙苗置于25～28℃溫室內,維持濕度90%,誘發病害發生。接種后每7 d調查1次發病情況,連續調查3次。病害分級標準與病情指數計算參照煙草行業標準YC/T39-1996[16]。

1.2.4 煙草黑脛病菌藥劑敏感性測定

將在燕麥培養基上培養了5～7 d的菌株,用直徑為5 mm的打孔器于距菌落中心等距、菌絲生長均勻處打取菌餅,菌面向下,分別接于含有不同濃度的甲霜靈和烯酰嗎啉的固體培養基平板上,每皿1片,置于25℃恒溫培養箱內黑暗培養,每個濃度4次重復。培養5 d后,用十字交叉法測量菌落直徑,計算生長抑制率。利用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析,計算EC50和抗性倍數,建立毒力回歸方程,求出相關系數[17]。

1.2.5 煙草黑脛病菌抗性水平劃分

參照胡燕[18]的方法劃分,以本實驗室保存的敏感菌株(甲霜靈敏感菌株FJ1和烯酰嗎啉敏感菌株JM01)的EC50為1.0,計算抗性倍數,根據抗性倍數將菌株分為敏感性菌株：EC50(R)/EC50(S)＜5;中抗菌株：5≤EC50(R)/EC50(S)＜20;高抗性菌株：EC50(R)/ EC50(S)≥20。

2 結果與分析

2.1 TTZ顏色反應鑒定結果

觀察發現,分離得到的24個供試菌株在TTZ液體培養基中培養72 h后,菌體變紅,且液體培養基呈現出淺紅色。在TTZ固體培養基上接種24 h后菌餅變為紅色,隨著培養時間的增加,紅色范圍逐漸擴大。試驗結果表明,供試菌株為0號或1號生理小種,而非3號生理小種[14]。

2.2 鑒別寄主鑒定結果

從表2可以看出,全部供試菌株在‘Florida301’品種上的反應表現為抗病至中抗,病情指數為16.24～45.38,在‘小黃金1025’品種上的反應表現為中感至感病,病情指數為50.82～91.34,但在‘NC1071’和‘N.nesophila’品種上的反應表現有所差異。其中15個菌株在‘NC1071’品種上表現為抗或中抗,在‘N.nesophila’品種上表現為感或中感,病情指數分別為9.85～30.52和50.27～75.07,其余9個菌株在‘NC1071’品種上的反應皆表現為感或中感,在‘N.nesophila’品種上表現為抗或中抗,病情指數分別為50.20～76.24和8.75～34.13。結合TTZ顏色反應結果,判斷來自瀘州主產區的24個菌株均為0號生理小種和1號生理小種,其中0號生理小種占62.50%,1號生理小種占37.50%,0號生理小種為四川省瀘州煙區煙草黑脛病菌的優勢小種。

表2 煙草黑脛病菌在鑒別寄主上的反應及生理小種類型Table 2 Physiological race and response of Phytophthora nicotianae on different hosts

續表2 Table 2(Continued)

2.3 煙草黑脛病菌對甲霜靈敏感性測定結果

采用菌落直徑法測定各菌株對甲霜靈的敏感性水平,從表3和圖1可知,甲霜靈敏感菌株(FJ1)的EC50為0.027μg/m L,瀘州煙區的24個田間菌株的EC50范圍在0.052～0.513μg/m L之間,其抗性倍數為1.98～19.37。來自古藺縣石屏鄉的菌株GL9最為敏感,來自古藺縣石莊鄉的菌株GL3最為耐藥,菌株GL3的EC50是菌株GL9的9.78倍。樣品中敏感菌株10個,占測定總數的41.67%,EC50平均值為0.098μg/m L,中抗菌株14個,占測定總數的58.33%,無高抗菌株。除GL3以外的菌株的EC50呈連續單峰頻次分布。

表3 煙草黑脛病菌菌株對甲霜靈的敏感性Table 3 Sensitivity of Phytophthora nicotianae isolates to metalaxyl

續表3 Table 3(Continued)

圖1 煙草黑脛病菌菌株對甲霜靈敏感性的頻數分布Fig.1 Frequency distribution of sensitivity of Phytophthora nicotianae strains to metalaxyl

2.4 煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉敏感性測定結果

試驗結果(表4)表明,烯酰嗎啉敏感菌株(JM01)的EC50為0.107μg/m L,測試菌株的EC50范圍為0.110～1.615μg/m L,抗性倍數為1.02～15.05。其中,敏感菌株9個,占測定總數的37.50%,中抗菌株15個,占測定總數的62.50%,EC50平均值為0.820μg/m L,無高抗菌株。古藺縣石莊鄉菌株GL3最為敏感,其EC50為0.110μg/m L,敘永縣麻城鄉菌株XY5的EC50(1.615μg/m L)最大,菌株XY5的EC50是菌株GL3的14.74倍。除GL10和XY5以外的菌株的EC50呈連續單峰頻次分布。

表4 煙草黑脛病菌菌株對烯酰嗎啉的敏感性Table 4 Sensitivity of Phytophthora nicotianae isolates to dimethomorph

圖2 煙草黑脛病菌菌株對烯酰嗎啉敏感性的頻數分布Fig.2 Frequency distribution of sensitivity of Phytophthora nicotianae strains to dimethomorph

2.5 不同地理來源菌株對甲霜靈敏感性水平的系統聚類分析

甲霜靈對供試菌株EC50的離差平方和系統聚類分析結果(圖3)表明：24個菌株的EC50可分為4個聚類組,第1組包括11個菌株(GL12、XY9、XY3、GL4、GL11、XY2、XY7、XY1、GL2、XY11、GL9),第2組包括2個菌株(XY4、XY10),第3組包括10個菌株(XY5、XY6、GL8、GL10、GL1、GL7、GL13、GL6、GL5、XY8),第4組僅包括1個菌株(GL3)。大部分菌株出現在第1和第3聚類組中,只有少部分菌株單獨聚成一類,古藺縣菌株樣品出現在除第2組外的其余3組中,而敘永縣菌株樣品出現在除第4組外的其余3組中,表明菌株對甲霜靈的敏感性與其地理來源具有一定相關性。同時,來自于古藺縣石屏鄉的4個菌株樣品在3個聚類組中出現,而古藺縣德耀鎮、敘永縣麻城鄉、敘永縣水潦鄉的菌株樣品在2個聚類組中出現,說明石屏鄉菌株抗性的變化幅度大,德耀鎮、麻城鄉、水潦鄉的菌株抗性變化幅度小,進而說明來自于同一煙區的菌株樣品抗性有所差異。GL3自成一組,EC50最大,和其他聚類組的差別最大。

2.6 不同地理來源菌株對烯酰嗎啉敏感性水平的系統聚類分析

烯酰嗎啉對供試菌株EC50的離差平方和系統聚類分析結果(圖4)表明：24個菌株的EC50可分為3個聚類組,第1組包括10個菌株(GL5、GL6、GL1、XY10、XY3、XY7、GL11、XY11、GL2、GL4),第2組包括12個菌株(GL3、GL7、XY1、XY2、XY9、 GL8、GL12、XY8、GL9、GL13、XY6、XY4),第3組包括2個菌株(GL4、XY5)。大部分菌株出現在第1和第2聚類組中,只有菌株GL10和XY5單獨聚成一類,古藺縣菌株樣品和敘永縣菌株樣品均出現在3個聚類組中,說明煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉抗性的地區性差異不明顯。同時,來自于古藺縣石屏鄉的4株菌株樣品和來自于敘永縣麻城鄉的4個菌株樣品均在這3個聚類組中出現,表明石屏鄉和麻城鄉菌株抗性的變化幅度大,再次說明來自于同一煙區菌株樣品抗性有所差異。XY5和GL10自成一組,其EC50和其他聚類組的差別最大。

圖3 煙草黑脛病菌菌株對甲霜靈敏感性水平的系統聚類分析Fig.3 Systemic cluster analysis of sensitivity level of Phytophthora nicotianae strains to metalaxyl

圖4 煙草黑脛病菌菌株對烯酰嗎啉敏感性水平的系統聚類分析Fig.4 Systemic cluster analysis of sensitivity level of Phytophthora nicotianae strains to dimethomorph

3 結論與討論

目前,國內外較為常用的煙草黑脛病菌生理小種鑒別寄主有‘NC1071’、‘L8’、‘Florida301’、‘N.nesophila’、‘N.nudicaulis’、‘N.plunbaginifolia’、‘N. stocktonii’、‘Burley21’、‘Burley37’、(‘L8’בBurley21’)F1、‘小黃金1025’等[1920]。朱賢朝等[5]認為‘L8’和‘NC1071’的抗性分別來自于‘N.longiflora’和‘N.plumbaginifolia’,兩者抗性基因片段相似,均為顯性單基因遺傳,對0號和1號生理小種的抗感反應穩定。然而,鑒于不同來源的‘L8’會對煙草黑脛病菌產生抗、感截然不同的結果,所以本研究沒有將‘L8’作為標準鑒別寄主[1]。‘N.nesophila’作為野生品種,基因比較穩定,自然變異性較小[15];‘Florida 301’作為抗病品種,‘小黃金1025’作為感病品種常應用于煙草黑脛病菌生理小種鑒定之中[57,2022]。因此,本研究最終選用‘NC1071’、‘N.nesophila’、‘Florida301’、‘小黃金1025’作為鑒別寄主。

目前,國內報道的煙草黑脛病菌生理小種為0號和1號生理小種。本研究結果表明,供試菌株中0號生理小種占62.50%,1號生理小種占37.50%, 0號生理小種是四川省瀘州煙區煙草黑脛病菌的優勢小種。本研究結果與王智發等[1]和李斌等[22]的研究結果不同,但與朱賢朝等[23]鑒定國內煙區1號生理小種為優勢小種的結果基本一致,推測這與鑒別寄主的選擇和取樣樣品差別有關。同時本研究結果與涼山州煙草黑脛病菌生理小種研究結果也有所不同[24],說明不同地域間煙草黑脛病菌生理小種分布有所差別。未來還需進一步擴大采樣范圍,以便確定瀘州煙區是否還存在其他煙草黑脛病菌生理小種類型。

甲霜靈和烯酰嗎啉作為內吸性殺菌劑因具有良好的治療作用而廣泛應用于煙草生產之中。但是這類藥劑對病菌作用位點單一,作用位點一旦發生突變,病菌就會產生抗藥性[12,25]。近年來隨著這兩種藥劑的抗性疫霉的相繼報道[12,2628],其抗藥性風險正逐步為人們所關注。本研究結果表明,24株分離物對甲霜靈敏感菌株占41.67%,中抗菌株占測定總數的58.33%,無高抗菌株。古藺縣石屏鄉菌株GL3甲霜靈抗性最高,古藺縣中抗菌株數量占中抗菌株總數的64.29%,說明古藺縣煙田中甲霜靈抗藥性菌株較多,應采取相應措施,避免抗藥性菌株的進一步增加。樣品中烯酰嗎啉敏感菌株占37.50%,中抗菌株占62.50%,無高抗菌株。古藺縣石莊鄉菌株GL3烯酰嗎啉抗性最低,敘永縣麻城鄉菌株XY5抗性最高。菌株GL3在兩種藥劑下的不同敏感性反映出藥劑的輪換使用可以有效避免抗藥性菌株的產生。兩種藥劑敏感性測定結果及菌株的抗性系統聚類分析結果表明,不同煙區菌株之間對甲霜靈的敏感性差異較大,而同一煙區不同菌株間的敏感性也有所差異。煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉抗性的地區性差異不明顯。

瀘州煙區已經有兩種藥劑的中抗菌株的出現,說明兩種藥劑均存在一定的抗性風險,鑒于甲霜靈抗性倍數大于10倍的菌株數多于烯酰嗎啉的菌株數,且古藺縣樣品中已經出現抗性倍數接近20倍的菌株,甲霜靈抗性風險更大。建議在改進藥劑使用技術的同時,合理進行藥劑的混用及輪換,以減緩瀘州煙區煙草黑脛病菌抗藥性產生的速度。下一步試驗應進一步增加取樣地區,同時進行煙草黑脛病菌對甲霜靈和烯酰嗎啉交互抗性的研究工作,為日后合理用藥提供理論依據。

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(責任編輯：王 音)

Races of Phytophthora nicotianae and their sensitivity to metalaxyl and dimethomorph in Luzhou,Sichuan

Zhan Huaixu1, Wen Nana1, Luo Dingqi2, Xia Jianhua2, Xu Chuantao2, Zhang Chengsheng1

(1.Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao 266101,China; 2.Luzhou Tobacco Company of Sichuan Province,Luzhou 646000,China)

Tobacco black shank,caused by Phytophthora nicotianae,is one of the most destructive diseases in Luzhou,Sichuan.In order to confirm the races of P.nicotianae and their sensitivity to metalaxyl and dimethomorph,24 strains of P.nicotianae were firstly isolated from samples of the tobacco production areas in Luzhou. All 24 isolates were identified as race 0 and race 1 based on host assay and TTZ color reaction.Fifteen isolates were identified as race 0,and 9 isolates were race 1,which accounted for 62.50%and 37.50%respectively.The sensitivity of these isolates to metalaxyl and dimethomorph were measured subsequently.The EC50values of metalaxyl to these isolates ranged from 0.052μg/m L to 0.513μg/m L,with the proportions of sensitive and moderate resistant strains of 41.67%and 58.33%,respectively.EC50values of dimethomorph to these isolates ranged from 0.110μg/mL to 1.615μg/mL and the proportions of the sensitive and the intermediate resistant strain were 37.50%and 62.50%,respectively.No high resistant strain to metalaxyl and dimethomorph was found.These results indicated that both of race 0 and race 1 of P.nicotianae existed in Luzhou and these isolates had developed fungicide resistance to metalaxyl and dimethomorph.

Phytophthora nicotianae; physiological race; fungicides sensitivity; metalaxyl; dimethomorph

S 435.72

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.033

2014-11-15

2015-01-09

國家煙草專賣局重點項目(110200902065);四川省煙草專賣局項目(201101007)

由煙草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的煙草黑脛病是一種極具毀滅性的病害,自1896年在印度尼西亞的爪哇首次被發現后,該病已廣泛分布于世界各煙草種植區[1],嚴重影響了煙葉的產量和品質。自20世紀60年代初,美國、南非、印度、中國等主要產煙國家相繼開展了大量的煙草黑脛病菌生理小種

*通信作者 E-mail：zhangchengsheng@caas.cn鑒定工作。目前已經明確了煙草黑脛病菌存在0號、1號、2號、3號,共4個生理小種,0號和1號生理小種廣泛分布于世界各煙區,2號生理小種發現于南非, 3號生理小種發現于美國[24]。朱賢朝等[57]和王智發等[1]報道我國主產煙區至少存在0號和1號兩個生理小種。瀘州煙區煙草黑脛病近年來發生嚴重,而關于瀘州煙區煙草黑脛病菌生理小種的研究尚未見報道。因此,本試驗對2010-2011年間瀘州煙區采集的煙草黑脛病菌樣品進行生理小種鑒定,旨在掌握瀘州煙區煙草黑脛病菌生理小種分布及組成情況。