從光學顯微鏡到光學“顯納鏡”

李 焱 龔旗煌

（北京大學物理學院，北京 100871）

光學顯微鏡（optical microscope）在生物學和醫學等眾多科學技術以及生產領域發揮著重要作用.16世紀至18世紀細胞等生物學和醫學的重大發現幾乎都與顯微鏡的重要改進分不開.進入20世紀，光學顯微鏡又有重要突破，分辨能力進入納米尺度[1-7].2014年獲得諾貝爾化學獎的超分辨熒光顯微鏡，已是名副其實的“顯納鏡”（nanoscope）.

1 光學顯微鏡的原理

顯微鏡的發明，大大提升了人類的觀察能力，打開了人類認識微觀世界的大門.人類感官接收的外部信息中，約90%以上通過眼睛傳遞給大腦.眼睛看見物體形成視覺的過程可以簡化成以下幾步（見圖1）：來自物體的光穿過角膜和瞳孔到達晶狀體后折射，折射光線穿過玻璃體在視網膜上形成像，再經視神經傳導至大腦視覺中樞形成視覺.其中黃斑附近視神經最發達，所以眼睛觀察物體時，通常將成的像調節到黃斑附近.由于瞳孔和晶狀體大小有限，而且感光細胞也有一定大小，當兩個物點距離太近時，形成的像斑重疊或落在同一感光細胞上時，眼睛便不能分辨.一般人眼的正常角分辨率為1′，對于眼睛敏感的綠光，兩個物點在1m處間隔大于0.3mm才能分辨清楚，亦即在明視距離（25cm）處兩個物點的間距要大于0.08mm才能分辨清楚.因此，人眼要看清整個長度僅為0.21mm的柄翅卵蜂等微小物體是極其困難的，但借助顯微鏡卻能做到.

圖1 眼睛成像示意圖

顯微鏡的使用已有400多年的歷史.16世紀，歐洲的眼鏡業已經很發達，放大鏡廣泛使用，磨鏡技術大大提高，為顯微鏡的出現奠定了基礎.1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經制造出類似顯微鏡的放大儀器.1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結構，當時的光學工匠紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進.

光學顯微鏡的成像系統主要由靠近物體的物鏡和靠近眼睛的目鏡組成，如圖2所示.被觀察物體位于物鏡的前焦點外側附近，經物鏡成一倒立的實像于目鏡前焦點內側附近，這個中間像經目鏡成一放大虛像于明視距離處.常規顯微鏡最大有效放大倍率接近500倍，分辨能力提升到亞微米.人們借助顯微鏡可以“看見”微米量級的微小物體.

2 光學顯微鏡的組成

圖2 光學顯微鏡成像原理圖

17世紀中葉，英國的羅伯特·胡克（Robert Hooke）和荷蘭的列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）對顯微鏡的發展作出了卓越的貢獻.1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動和微動調焦機構、照明系統和承載標本片的工作臺.這些部件經過不斷改進，成為現代顯微鏡的基本組成部分.常見的光學顯微鏡一般由載物臺、聚光照明系統、物鏡和目鏡組成的成像系統和調焦機構組成.早期的光學顯微鏡只是光學元件和精密機械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像.后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲的接收器.現代又普遍采用光電元件、電視攝像管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計算機后構成完整的圖像信息采集和處理系統，如圖3所示.

圖3 光學顯微鏡的組成

3 光學顯微鏡對生物學發展的推動作用

顯微鏡的發明極大地促進了生物學和醫學等學科的發展.1665年，胡克利用顯微鏡觀察軟木的木栓組織上的微小氣孔，并命名為“細胞”.圖4為胡克顯微鏡.

圖4 胡克顯微鏡

1674年，列文虎克發現了原生動物，并隨后發現了“細菌”，創建微生物學，他還發明了高倍物鏡的研磨和拋光方法，被稱為“顯微鏡之父”.1833年，布朗 （Brown）通過顯微鏡觀察紫羅蘭，隨后發表了對“細胞核”的詳細論述.1857年，寇利克（Kolliker）發現了細胞中的“線粒體”.1879年，佛萊明 （Flemming）發現了動物細胞進行有絲分裂時，其清晰可見的染色體活動過程.人們借助顯微鏡逐漸描繪出細胞的結構，植物葉肉細胞的立體結構模型如圖5所示.

1888年，以卡嘉爾（Cajal）為首的組織學家發展出顯微鏡染色觀察法，為顯微解剖學奠定了基礎.1932年，澤尼克（Zernike）發明出相襯顯微鏡，可以直接觀察活細胞和未染色標本，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學獎.1952年，諾馬斯基（Nomarski）發明了微分干涉相襯光學顯微鏡，能顯示細胞等立體影像.1988年，共焦掃描顯微鏡投入使用，不僅可以用于觀察細胞形態，也可以用于進行細胞內生化成分的定量分析和實現長時間活細胞動態觀察.1990年，發展了非線性光學多光子顯微成像技術，可以獲得生物細胞、活組織的長時間動態三維成像.

4 阿貝衍射極限

雖然光學顯微鏡發展迅速，但是人們繼續提高常規光學顯微鏡分辨能力卻遇到了不可逾越的障礙，常規光學顯微鏡不能分辨病毒或比其更小的東西，這是受到阿貝衍射極限的限制，如圖6所示.由于衍射的存在，物鏡、眼睛等無法把光線匯聚成無限小的點，而只會在像平面上形成有限大小的艾里斑（中心是很亮的斑，外圍是明暗相間的環）.光學儀器成像過程中，是把物平面上的無數微小的點轉換成艾里斑，然后再把它們疊加起來呈現在像平面上.

艾里斑的大小與光學系統有關，而能分辨的最小細節由瑞利判據決定.假如物平面上有兩個點，通過一個光學成像系統后產生兩個艾里斑.當這兩個點離得較遠時，像平面上的艾里斑也會離得較遠——此時我們可以很容易地分辨出物平面上有兩個點.如果把兩個點逐漸移近，艾里斑也會隨之接近.當這兩個艾里斑接近到一個圓斑中心與另一個圓斑邊緣重合的時候，我們達到能夠分辨出有兩個點的極限（這就叫瑞利判據）.如果這兩點再接近，像平面上的兩個艾里斑互相重疊在一起，實際看起來成為一個圓斑，那物平面上的兩個點就不能分辨了，如圖7所示.早在1872至1873年，阿貝（Ernst Abbe）通過分析指出，在常規光學顯微鏡中，恰能分辨時兩點的距離約為半波長.可見光中波長最短的藍光波長約400nm，這意味著光學顯微鏡能分辨出的物體最小距離約0.2μm（200nm）.因此0.2μm 成為光學顯微鏡能夠達到的最高分辨率，也就是我們通常所說的阿貝衍射極限.細胞的許多內部結構以及大部分病毒的尺寸，都在200nm左右或者更小，常規光學顯微鏡就無能為力了.

圖7 阿貝衍射極限示意圖

5 光學“顯納鏡”—超分辨熒光顯微鏡

為了繞開阿貝衍射極限的限制，很多人選擇了其他顯微技術，利用光學近場掃描技術或非線性光學方法，或使用波長極短的電子顯微鏡（分辨率能達到0.2nm），但是這些方法不利于活體生物樣品大視角遠場實時觀察.2014年獲得諾貝爾化學獎的埃里克·貝齊格、斯特凡·黑爾和威廉·莫納（圖8）獨辟蹊徑，突破阿貝衍射極限，將分辨能力提升到納米量級，實現了超分辨熒光顯微技術，又大大推動了生物學和醫學的發展.

圖8 獲得2014年諾貝爾化學獎的3位科學家

超分辨率熒光顯微鏡利用了熒光分子的發光特性.熒光分子能夠吸收一種波長的光，放射出另外一種波長的光.熒光分子有一定的壽命，其持續發光一段時間后，將不能繼續發光.熒光分子可以是熒光蛋白質分子，也可以是有機分子.

在莫納之前，人們觀測熒光分子時都是同時觀測到幾百萬甚至幾千萬個分子，得到的結果是其平均統計結果.而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人，在1989年，那是一項偉大的成就.能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要，并啟發大量化學家將他們的注意力轉向單分子研究，其中一位便是埃里克·貝齊格.雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2μm的愛里斑，但是在沒有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以通過大量統計而精確地定位，定位精度能可以達到1nm.

莫納的另一個貢獻是發現了像控制電燈泡一樣方便地控制熒光蛋白發光的方法即光激活（photoactivation）.1997年，莫納來到加州大學圣迭戈分校，后來被授予諾貝爾獎.綠色熒光蛋白技術的發明人錢永健也在這里任職.錢永健從水母體內分離出發綠色熒光的蛋白，其重要意義在于它能夠讓活體生物體內細胞的其他蛋白質同樣變得可見.運用基因技術，科學家們將這些微小的綠色熒光蛋白與其他類型的蛋白進行結合.這樣，利用綠色熒光作為標記，科學家們便能知道那些被標記的蛋白質在生物體內所處的位置.莫納注意到一種綠色熒光蛋白分子，其熒光可以被隨意地開啟或關閉.當用波長488nm的光激發這一蛋白質時，它開始發出熒光，但過一會之后它就熄滅了.此后不管再使用多少光去照射它，這個蛋白質的熒光都已經死了.然而如果使用波長為405nm的光去照射它，這個蛋白質又能再次復活并發出熒光.當該蛋白質被再次激活，它會再次發出波長為488nm的熒光.莫納將這些可以被光激活的蛋白質均勻分散到一種凝膠中，這樣其單個分子之間的距離就能大于阿貝衍射極限所限定的0.2μm的長度.由于這些分子被分散開來，一臺常規的光學顯微鏡便可以區分來自單個分子發出的熒光——它們就像是帶著開關的微小燈泡.這一發現顯示了通過光學手段操控單個分子熒光的可能性，解決了兩年多一直困擾著埃里克·貝齊格的問題.

貝齊格發明的超分辨率顯微鏡叫光激活定位顯微鏡（PALM：PhotoActivated Localization Microscopy），利用了莫納發現的光激活方法.貝齊格利用微弱的405nm激光照射樣品，使得其中極小部分熒光分子能夠發出熒光.由于這些發光的熒光分子很稀疏從而相距較遠，它們的位置能夠精確地確定下來.等這些分子失去活性后，再次照射405nm激光而激活另一小部分熒光分子.重復這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來，從而得到整個樣品的圖像，其原理如圖9所示.

圖9 單分子熒光顯微原理

溶酶體膜的光激活定位顯微鏡成像與傳統光學顯微鏡成像的比較如圖10所示，可以看出超分辨光激活定位顯微鏡確實是“顯納鏡”.

幾乎與貝齊格2006年發明PALM同時，哈佛大學化學系與物理系的華人教授莊小威也獨立發明了另一種超分辨率顯微鏡-隨機光學重構顯微鏡 （STORM：STochastic Optical Reconstruction Microscopy）.PALM和STORM這兩種顯微技術不僅同年，而且原理也基本一致.不同之處在于貝齊格利用的是光激活蛋白，而莊小威使用的是有機熒光分子對.圖11是常規顯微鏡和STORM顯微鏡拍攝的線粒體圖像.

圖10 溶酶體膜的顯微成像

圖11 一個細胞中的線粒體

黑爾發明的受激發射損耗（STED：STimulated Emission Depletion）顯微技術，直接實現對點擴展函數的調制，能夠實現更快的成像速度，對熒光染料依賴程度低，因此備受關注.科學家們利用受激發射原理可以冷卻熒光分子，即將一束特定激光束對準一個熒光分子，后者立即失去能量并變得黯淡.1994年，黑爾提出了受激發射損耗顯微技術的設想，計劃采用一束激光來激發所有的熒光分子，隨后利用另外一束激光讓所有分子熒光熄滅——那些位于中心位置上納米尺度空間內的熒光分子除外.當進行記錄時則只記錄下這一納米部分.讓這一光束掃過整個樣品表面，并連續記錄光強信息，就有可能得到一張整體圖像.每次允許發出熒光的空間區域越小，最后得到的圖像分辨率便越高.于是，從原理上說，對于光學顯微成像的極限再也不復存在了，如圖12所示.

圖12 受激發射損耗顯微原理

多年以后這項理論才得以在實踐中被證實.在那段時間里，黑爾一邊繼續科研工作，一邊四處奔走籌集科研經費.2000年，他證明了自己的技術方法在實際工作中是可行的.當時他對大腸桿菌進行了拍攝，其分辨率是此前任何光學顯微鏡都未能達到過的（圖13）.

圖14是常規顯微鏡和受激發射損耗顯微鏡拍攝的一個人類腦瘤樣本的對比圖像，不難看出超分辨受激發射損耗顯微技術的巨大優勢.

圖13 第一張由黑爾使用受激發射損耗顯微技術拍攝的大腸桿菌圖像

圖14 一個人類腦瘤樣本

6 結語

超分辨熒光顯微技術是物理思想、化學方法、光學技術和分子探針相結合的產物，大大提高了人們認識微觀世界的能力，光學顯微鏡進入了“顯納鏡”時代，并在眾多領域得到了廣泛應用.光學顯微鏡不斷帶動許多學科的發展，現在的功能越來越強，也必將繼續促進科學技術和社會進步.

[1]谷祝平.光學顯微鏡[M].蘭州：甘肅人民出版社，1985.

[2]光學顯微鏡網站：http：／／micro.magnet.fsu.edu／primer／index.html

[3]毛崢樂，王琛，程亞.超分辨遠場生物熒光成像 -突破光學衍射極限[J].中國激光，2008，35（9）：1283-1307.

[4]李明.超分辨顯微，至極至美：2014年諾貝爾化學獎述評[J].物理，2014，43（12）：813-816.

[5]2014年諾貝爾化學獎網站和相關文獻：http：／／www.nobelprize.org／nobel＿prizes／chemistry／laureates／2014／

[6]顧牡，王青.有光的日子—— 寫在2015國際光年 [J].物理與工程，2015，25（1）：封2.

[7]鐘錫華 .光，你這個精靈 [J].物理與工程，2015，25（1）：14-19.