地表水中微囊藻毒素的檢測分析方法

趙起越，趙紅帥，劉保獻，徐蘇士

（北京市環境保護監測中心，北京 100048）

地表水中微囊藻毒素的檢測分析方法

趙起越，趙紅帥，劉保獻，徐蘇士

（北京市環境保護監測中心，北京 100048）

藍藻水華會向地表水中排放大量的微囊藻毒素，對水生動、植物及人類構成很大威脅。綜述了國內外分析微囊藻毒素的方法，包括生物檢測法、生物化學檢測法、化學儀器檢測法等，指出了地表水中微囊藻毒素檢測分析方法的發展趨勢。

地表水；微囊藻毒素；分析

隨著經濟的發展及人口的增加，地表水體富營養化日益嚴重，污染水體中的藻類快速生長繁殖，引發藻類水華。藍藻水華爆發頻率較高，向水體釋放出大量的藻毒素，嚴重影響水體生態環境，威脅水生動、植物的生長及人體健康［1-2］。其中最常見的毒素為微囊藻毒素（microcystin，MCs）。MCs是一種具有生物活性的環狀縮氨酸，基本結構為環（D-Aka-L-X-D-Masp-L-YAdda-D-Glu-Mdha），L、D為左、右旋，D-Aka為D-丙氨酸，D-Masp為D-赤-甲基-β-D-異天冬氨酸，Adda為3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸，DGlu為D-異谷氨酸，Mdha為N-甲基脫氫丙氨酸。X和Y為兩種可變的氨基酸。

MCs有近90種異構體，其中研究較多的有MCLR、MC-RR及MC-YR等。MCs具有肝毒性，是一種強腫瘤促進劑，不僅損害飲用及接觸污染水體的生物健康，還會通過食物鏈富集，對人類健康構成威脅。微囊藻毒素溶于水，有較強的耐熱性及酸堿穩定性。普通自來水處理工藝難以將其有效去除［3］。世界衛生組織（WHO）設定飲用水中MC-LR的濃度指導限值不得大于1μg·L－1［4］，我國《地表水環境質量標準》及《生活飲用水衛生標準》均采用了WHO的濃度限值［5-6］。

微囊藻毒素濃度與藍藻水華的程度息息相關。研發準確、快速的測定方法對控制藍藻水華、保護地表水環境安全具有重大意義。由于微囊藻毒素種類繁多、結構相似、濃度很低，加之地表水中存在許多干擾物質，準確而快速地定量測定MCs具有一定難度。MCs的分析方法種類繁多，作者在此主要介紹生物檢測法、生物化學檢測法及化學儀器檢測法等MCs檢測方法。

1 生物檢測法

生物法檢測MCs是通過動、植物體外攝入MCs，觀察個體或組織器官的反應變化。研究常通過灌喂或腹腔注射小白鼠鑒定MCs的毒性，周期較長。Torokne等［7］使用甲殼綱無甲目豐年蟲進行了水中MCs亞致死點1 h Rapidtoxkit實驗及死亡率24 h實驗，兩種實驗結果相關性好，因此可以用1 h實驗代替24 h實驗，快速、經濟地檢測MCs。目前，使用細菌測定MCs毒性的報道較多，如費舍爾弧菌或明亮發光桿菌等，最多能檢測5種MCs［8-9］。2008年，南非第一次出現了使用鲇魚肝細胞進行動物實驗的報道，細胞暴露后，進行抽樣、抑制及引發等實驗，結果與酶聯免疫法相符，與小白鼠動物實驗完全一致，該方法可能在不遠的將來替代動物活體實驗［10］。此外，還有使用植物檢測水中MCs的報道［11］。

生物法操作簡單，結果直觀，但成本較高，特異性不好，無法區別不同的MCs異構體，也不能對毒素進行準確定量。

2 生物化學檢測法

2.1 蛋白磷酸酶抑制分析法（protein phosphatase inhibition analysis，PPIA）

MCs能阻斷抑制真核蛋白磷酸酶PP1及PP2A的活性，因此通過測定放射性同位素32P標記底物或對硝基苯基磷酸酶類底物，獲取蛋白磷酸酶PP1及PP2A的抑制情況，可以得到MCs的濃度。Rivasseau等開發了一種免疫與比色實驗相結合的蛋白磷酸酶抑制方法，樣品經免疫萃取后進行磷酸酶抑制檢測，可對MCs水華毒性進行快速的在線監測。Covaci等［12］研究了3種蛋白磷酸酶被MCs抑制的情況，使用其中2種、依據人工神經網絡對MC-LR及MC-YR進行了定量檢測。這種檢測方法成本低，可用于常規環境樣品的篩選，但特異性不好，干擾較大。

2.2 酶聯免疫法（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）

ELISA根據抗體對MCs的識別進行檢測，ELISA又分為抗原抗體復合物酶聯免疫法（anti-immune complex ELISA，IC ELISA）、間接競爭酶聯免疫法（indirect cELISA）和直接競爭酶聯免疫法（direct cELISA）3種。雷臘梅等［13］采用水樣、藻樣和水產品對上述方法進行了系統比較，證明IC ELISA靈敏度高、穩定性好、特異性強，而且不需要預處理樣品，檢測限符合國內外相關法規要求。ELISA實驗多數使用免疫診斷試劑盒進行，如Gurbuz等［14］使用自制的多克隆抗體試劑盒及一種市售的試劑盒對水體中的MCs進行了分析，同時使用液相色譜對結果進行了確證。結果表明：多克隆抗體法比單克隆抗體法重復性好，制備也比較方便、快速，雖然檢測限比單克隆法高，但可以滿足水中MCs的測定要求。

一般的ELISA不能對不同MCs異構體區別檢測，對MCs及其它有類似結構的物質也不能加以區分，因此測量結果有時會產生偏差。

目前，免疫傳感器的研制工作非?；钴S。將免疫測定法與傳感技術相結合，產生了一類新型生物傳感器——免疫傳感器。此類傳感器利用抗原與抗體的特異性吸附反應對目標化合物進行測定。MCs免疫傳感器應用分直接測定（非標記型）及間接測定（標記型）兩種［15-16］。張金果等［17］研制出基于Fe3O4@Au磁性納米粒子修飾絲網印刷電極的免疫傳感器，并進行水中MC-LR測定，其響應峰電流值與化合物濃度在0.79～12.9μg·L－1范圍內呈良好的線性關系，檢測限為0.38μg·L－1。杜華麗等［18］使用基于石墨和金納米籠修飾的無標記型微囊藻毒素免疫傳感器進行污染物的測定，考察了抗原培育時間及抗體濃度等條件對傳感器響應性能的影響，操作簡單，穩定性很好。Shi等［19］建立了新型在線自動光度生物傳感系統，使用間接競爭檢測模式對飲用水中的MC-LR實現了快速、自動、在線、實時檢測，MC-LR的定量范圍為0.2～4.0μg·L－1，檢測限可達0.09μg·L－1。Morais等［20］應用間接競爭微免疫反應研制出微傳感器，實現了現場、原位、快速、高通量的分析，對水中MCLR的檢測限可達1.04μg·L－1，線性范圍0.12～200 μg·L－1，37 min內可同時分析42個樣品。

免疫傳感器特異性強、靈敏度高、準確性好，納米材料的引入，使它的諸多性能有很大提升。但多數傳感器僅能測定MC-LR，且非標記傳感器分析MCs等小分子化合物時的靈敏度不夠高。此外，多數傳感器不能勝任大量環境樣品長時間連續分析的任務，在使用壽命、再生性、有效性及穩定性等方面也需要進一步完善［21］。

2.3 分子技術檢測法

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴增技術，因為特異多肽合成基因僅存在于產毒微囊藻藻株中，通過檢測藻類基因組DNA中是否含有該基因簇，判斷被檢藻株的產毒能力，此為全細胞PCR分析法。Saker等［22］使用該法研究葡萄牙水體中MCs，檢測結果與使用基體輔助激光消解-飛行時間質譜檢測結果一致。Calvo等［23］使用五巢式PCR在西班牙Aragón不同水體中同時檢測了5種單細胞生物，對其中主要病原體進行了識別。實時熒光定量PCR技術是指在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化實時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量。它操作簡單、快速高效，靈敏度和特異性均很高，可以通過不同的引物設計在同一反應體系中同時對多個靶基因分子進行擴增。如Juliana等［24］設計了mcyD特異片段引物，采用PCR評估了水中藍藻數量。而Kyoung-Hee等［25］以mcyA基因為研究對象，使用PCR估算了銅綠微囊藻在藍藻種群中的比例，進行了藍藻水華風險的評估。基因核苷酸探針DNA芯片技術大大提升了實時PCR的分析通量，對藍藻水華測定的靈敏度可達1 000 cell· mL－1［26］。PCR技術的缺陷是，隨著放大產物長度的增加，放大效率逐漸降低，優化工作難度加大，檢測時間延長［27］。

3 化學儀器檢測法

3.1 前處理方法

3.1.1 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）

大多數分析方法均要使用固相萃取技術從水中提取MCs。萃取柱活化后將水樣注入，再使用溶劑依次洗脫雜質及MCs，含有MCs的洗脫液經濃縮換相，使用儀器進行分析。這部分研究主要集中在萃取柱的填料、孔徑、雜質及目標化合物洗脫條件的選擇和比較上［28］。Sep-Pak C18、Supelco LC-Si及HLB等SPE柱的研究較多，一般認為HLB的萃取效果較好，因為其填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有較高的吸附容量［28-29］。

水中MCs使用固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）技術的報道不多，主要因為該技術萃取平衡時間較長（＞20 h），實用性不強［30］。自動固相萃取是將SPE自動化，使用機械泵自動抽取分析水樣及洗脫溶液。節約了人工，但儀器造價較高，系統維護費用及工作量較大。1999年，Lee等［31］使用一種在線富集裝置，將水樣過濾后，直接上機富集，富集柱為Zorbax腈基柱，流速0.3 mL·min－1。該研究使用液相色譜分析了水中MC-LR、MC-YR及MC-RR。單芯片SPE技術使用芯片作固定相，可以在低壓下達到較高的流速，分析速度快，靈敏度高。芯片可以反復使用，經濟實惠。Ammerman等［32］開發了一種流動注射（flow injection，FI）結合單芯片SPE萃取分析地表水中痕量MCs的方法，該方法比傳統SPE目標化合物的半峰寬減少近20%，靈敏度提高近10倍。

3.1.2 直接進樣法

直接進樣法指水樣不經過萃取，通過濾膜后直接進入儀器（通常為液相色譜）進行分析。近年來，隨著液相色譜-質譜及多級質譜的出現，儀器檢測的靈敏度有了很大提高，抗干擾能力也大大增強，直接進樣法的報道也越來越多［33-35］。該方法的研究集中在過濾膜材質的選擇和進樣量、色譜條件的篩選上。楊立新等［33］使用直接進樣液相色譜-串聯質譜測定了自來水、地下水及地表水中的8種有機物，包括2種MCs，通過色譜及質譜條件的優化，8種有機物于6 min內分析完畢，2種MCs的線性范圍較寬，相關系數達0.99以上。姜雷等［34］使用同種方法測定了水中9種藻毒素，用腦啡肽作內標，定量限為0.012～0.360μg· L－1。茅海瓊等［35］使用直接進樣法分析了環境水質樣品中MC-LR，采用超高效液相色譜-串聯質譜，回收率為91.5%～110.3%，檢測限為0.08μg·L－1，符合《地表水環境質量標準》及《生活飲用水衛生標準》的要求。

3.2 儀器分析

3.2.1 氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）

以過碘化鈉及高錳酸鉀氧化MCs得到2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁基酸，使用氣相色譜-火焰離子化檢測器或GC-MS進行定量，間接求得MCs總量［36］。Patricia等［37］使用上述方法，酯化衍生配合SPME，提高了回收率及靈敏度，可以分析水中及魚的不同組織內積累的MCs。氣相色譜-化學電離源-質譜方法使用紅-2-甲基-3-（甲氧基-d3）-4-甲基丁基酸作內標，對水體中MCs測定更加靈敏［38］。GC-MS方法靈敏、快速、準確，但樣品處理復雜，且只能測定MCs的總量，不能鑒別不同的異構體。

3.2.2 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）

LC適于分析MCs這種揮發性不強、熱穩定性高、沸點較高的物質，WHO及我國權威機構推薦的方法均為HPLC方法。MCs的LC分析通常使用反相硅膠柱，由于流動相中添加小比例的酸可以提高MCs測定的靈敏度，因此色譜柱需要有一定的耐酸性。Xterra、Symmetry、Luna、Atlantis等色譜柱的使用均有報道。流動相甲醇及乙腈均有使用，流動相流速及組成比例依據分析的目標化合物及進樣方式不同而異。LC分析MCs可以使用紫外（UV）、二極管陣列（diode array detector，DAD）及質譜（MS）等檢測器。

3.2.2.1 紫外及二極管陣列檢測器

因為MCs含有Adda官能團，最大吸收波長為238 nm，因此LC與DAD或UV聯用技術成為檢測MCs的最廣泛使用的手段。Mankiewicz-Boczek等［39］使用LC-DAD測定了波蘭3個湖泊夏季水中的MCs，并與PCR方法進行了比較，含P阿氏藻的水樣最大濃度可達11.13μg·L－1，而含M阿氏藻的為4.67μg·L－1。Shen等［40］使用LC-UV測定了太湖發生水華時梅梁灣的湖水，發現MC-LR是主要的有毒組分，其中MCs的含量與湖水溫度及富營養狀況有關。LC-UV法靈敏度不高，對化合物的定性定量要依據標準物質，另外，有些化合物在200～300 nm之間有紫外吸收，會干擾測定。

3.2.2.2 質譜檢測器

LC-MS分析水中MCs分析靈敏度高，通量大，對目標化合物采用保留時間及核質比雙重定性，準確度更高。質譜通常采用熔接快原子轟擊技術、電噴霧電離技術（electron spray ionization，ESI）及大氣壓化學電離技術（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）等幾種電離技術獲得分子離子，其中ESI使用最多［41］。Jurcza等使用LC-ESI-MS分析了波蘭1996年至2001年8個水體中的MCs，發現主要污染物為MCRR、MC-LR及MC-YR，還發現了幾種去甲基MCs［42］。Hoeger等［43］使用LC-MS分析了前-阿爾卑斯湖泊中的藻類，發現了2種MC-RR的變異體，并應用多級質譜加以確認。

LC與多級MS聯用使用母離子和子離子共同定性定量，對MCs的測定更加準確［44］，這方面的報道很多，如Ortea等［45］使用LC-MS-MS分析了愛爾蘭被MCs污染的湖水，檢出了MC-LR和MC-LA。MC-LR的分析重現性好，線性及變異系數均達到要求。鄧力等［46］使用LC-MS-MS分析了重慶長壽湖中3種MCs，分析僅用6 min，檢測限達到ng·L－1級，回收率為85.6%～107.9%。Kaloudis等［47］使用LC-ESI-MS-MS分析了馬拉松湖水中的MCs及神經毒素，發現了MC-LA一種新的斷裂機理，神經毒素的回收率為70%～114%，檢測限達到2 ng·L－1。

應用LC-MS-MS方法時因不同目標化合物的離子化程度不同，有時會產生誤差，使用同位素內標可以消除［48］。有時還可以添加替代物，進一步修正前處理產生的誤差［49］。除此以外，應用這一技術還可以確證未知MCs，如可以根據Adda側鏈m/z135證明分析物是MCs［50］。因此，LC-MS-MS逐漸成為分析MCs的有力工具。

MS一般為四級桿質譜，如果使用飛行時間質譜（time of flight MS，TOFMS），檢測靈敏度還會提高。Ortelli等［51］使用超高效液相色譜與TOFMS聯用定量測定水中MCs，檢測限可達0.1μg·L－1。

3.2.3 基體輔助激光解析離子化（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）-飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）及表面加強激光解析電離（surface-enhanced laser desorption ionization，SELDI）-飛行時間質譜（SELDI-TOFMS）

MALDI-TOFMS及SELDI-TOFMS是新發展起來的軟電離生物質譜。分析快速、靈敏度高、選擇性好、樣品用量少、對無機鹽及緩沖液有一定耐受性，該儀器的高通量、多路復用性能適于分析MCs及其異構體［52］。Via-Ordorika等［53］使用MALDI-TOFMS對歐洲9個國家的MCs菌落進行了分析，共檢出8個不同MCs異構體。有人使用疏水芯片萃取水中MCs，使用SELDITOFMS測定，每2μL樣品中可檢出MC-LR 2.5 pg，但方法基體效應很大，很難監測到MCs的m/z135的特征離子碎片［54］。

3.2.4 其它分析方法

其它MCs的分析方法包括毛細管電泳、薄層色譜和二維核磁共振等，各方法比較見表1。

4 發展趨勢

隨著經濟的發展及人口的增加，地表水體富營養化程度不斷加劇，水中MCs的分析非?；钴S，呈現出以下發展特點：

表1 其它MCs分析方法比較Tab.1 Com parison of other analyticalmethods of MCs

4.1 分析的MCs種類逐漸增多

可分析的水中MCs已從過去的一、兩種（MC-LR及MC-RR）增加至近十種，而且還增加了神經毒素、柱狀藻毒素、節球藻毒素等易于伴生的毒素，并與微囊藻毒素一起進行同步分析。

4.2 前處理方法逐漸簡化

從起始的離線固相萃取到自動固相萃取、在線固相萃取，現在已發展至直接進樣。水樣只要用濾膜過濾后便可上機分析。在生化分析方面，生物試劑盒已普遍使用，分析快速，便于大量樣品的篩查。

4.3 分析儀器越來越先進，檢測精度越來越高

雖然現在水中MCs的常規檢測還是使用LC-UV，但MS方法已經被廣泛采用，甚至多級MS的使用也愈來愈多，TOFMS的使用也有少量報道。MS的引入使MCs的儀器測量精度有很大提高，在不遠的將來必定成為MCs儀器分析的主流。

4.4 高通量、現場、原位、實時測定

目前，世界上還沒有較為成熟的防止藍藻水華發生的有效辦法，因此對水中MCs必須進行密切監控。生物試劑盒、免疫傳感器等技術的發展應用使地表水中MCs的實時、原位、在線檢測成為可能。納米材料的引入大大提高了傳感器靈敏度、穩定性和抗體分子吸附量。生物傳感器對MCs的現場、實時、原位分析將與經典分析方法同時存在、共同發展、互為補充。

5 結語

地表水中MCs的檢測分析方法發展迅速，且日趨多元化。更多的異構體、變異體分析、更少的前處理步驟及更精確、快速、高通量及經濟的分析方法成為發展的方向，實時、原位的現場分析方法也方興未艾。結合我國國情，在擴展分析目標化合物種類的同時，須逐步開展不同方法之間的比對、同一方法不同設備之間的比對研究，尤其是新建方法與國標方法的比對工作，以確認方法的有效性。此外，要加強我國地表水中微囊藻毒素標準評價體系的構建工作，綜合動物實驗、流行病學研究及國內外文獻，建立符合我國國情的地表水中微囊藻毒素的標準評價體系，并在此框架下配套進行方法學研究。

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Detection and Analytical M ethods of M icrocystins in Surface W ater

ZHAO Qi-yue，ZHAO Hong-shuai，LIU Bao-xian，XU Su-shi
（Beijing Municipal Environmental Monitoring Center，Beijing 100048，China）

Microcystins（MCs）in surface water discharged during cyanobacterial blooms is a big threat to water plants，animals and human.Analyticalmethods of MCs from home and abroad are reviewed，including biologicalmethod，biochemicalmethod，chemical instrument analyticalmethod，etc.Developing trend of detection and analyticalmethods of MCs in surface water is pointed out too.

surface water；microcystins；analysis

O 657

A

1672-5425（2015）07-0009-06

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.003

2015-03-07

趙起越（1968－），女，北京人，教授級高級工程師，研究方向：環境有機污染物分析，E-mail：qiyuezhao@126.com。