硝基羥乙唑與溶菌酶反應(yīng)機(jī)制的熒光光譜研究

劉保生,韓 榮,李志云,李彤彤,李改霞

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071002)

硝基羥乙唑與溶菌酶反應(yīng)機(jī)制的熒光光譜研究

劉保生*,韓 榮,李志云,李彤彤,李改霞

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071002)

分別在298,310,318 K溫度下,利用熒光光譜法研究了pH=7.40生理?xiàng)l件下硝基羥乙唑(TRI)與溶菌酶(LYSO)的相互作用機(jī)理。結(jié)果表明,TRI與LYSO間通過靜態(tài)猝滅方式相互作用。測定了LYSO與TRI反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。利用反應(yīng)過程的熱力學(xué)參數(shù),確定了LYSO-TRI體系的作用力類型;由Hill系數(shù)得出了LYSO或TRI的協(xié)同性;根據(jù)非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,確定了TRI到LYSO的結(jié)合距離,同時(shí)采用同步光譜法考察了TRI對(duì)LYSO構(gòu)象的影響。

熒光光譜法;同步光譜法;溶菌酶;硝基羥乙唑;反應(yīng)機(jī)理

1 引 言

溶菌酶(lysozyme,LYSO)[1]是一種廣泛存在于生物體內(nèi)唾液、眼淚、血液、淋巴組織等部位的免疫球蛋白,單體分子的多肽鏈由129個(gè)氨基酸殘基組成,包括6個(gè)色氨酸殘基(Trp 28、Trp 62、Trp 63、Trp 108、Trp 111和Trp 123)、3個(gè)酪氨酸(Tyr)殘基和4對(duì)二硫鍵來維持構(gòu)型。另外,LYSO一個(gè)重要的功能就是可以運(yùn)載小分子物質(zhì)[2],通過與藥物小分子的結(jié)合作用達(dá)到治愈疾病的效果。

硝基羥乙唑(TRI)[3]是現(xiàn)今結(jié)構(gòu)簡單并且應(yīng)用廣泛的抗厭氧菌的藥物,主要用于治療擬桿菌、彎曲桿菌、俊狀芽孢桿菌等厭氧菌感染的治療。目前關(guān)于LYSO的研究較多,但沒有報(bào)道過與TRI作用機(jī)制的研究。本文通過熒光光譜法、同步光譜法來研究TRI和LYSO的相互作用信息及TRI對(duì)LYSO構(gòu)象的影響,為更好地了解藥物在體內(nèi)的輸送和作用機(jī)制提供了重要信息。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器:日本SHIMADZU制作所的RF-5301PC熒光分光光度計(jì)和UV-265紫外可見分光光度計(jì);上海雷磁儀器廠的pHS-3C型精密酸度計(jì);南京桑力電子設(shè)備廠的SYC-15B型超級(jí)恒溫水浴。

試劑:溶菌酶(LYSO,美國Sigma公司,純度≥99%)配成濃度為2.0×10-5mol/L的儲(chǔ)蓄液;硝基羥乙唑(TRI)標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司,純度≥99%)配成1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)蓄液,用時(shí)依次稀釋;Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.15 mol/L NaCl,pH=7.40)。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水,溶液于4℃冰箱保存。TRI的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 硝基羥乙唑的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of TRI

用“內(nèi)濾光效應(yīng)”公式[4]對(duì)實(shí)驗(yàn)所測熒光強(qiáng)度進(jìn)行校正:

校正后和觀察到的LYSO-TRI體系熒光強(qiáng)度用Fcor和Fobs表示,TRI在激發(fā)和發(fā)射波長處的吸光度值用Aex和Aem表示。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

在298,310,318 K下,在一系列10 mL比色管中依次加入1.0 mL的Tris-HCl緩沖溶液、0.2 mL濃度為2.0×10-5mol/L的LYSO溶液及不同濃度的TRI溶液,定容、搖勻,水浴靜置20 min。激發(fā)波長λex=280 nm或295 nm,狹縫寬度5 nm,掃描LYSO-TRI體系的熒光光譜。同時(shí)固定波長差Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm,記錄LYSOTRI體系的同步熒光光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 LYSO-TRI體系的熒光猝滅光譜

TRI對(duì)LYSO的熒光猝滅見圖2(λex=295 nm時(shí)的譜圖與其類似)。由圖2可知,TRI能夠猝滅LYSO的熒光且LYSO發(fā)射峰紅移20 nm,表明TRI與LYSO作用生成復(fù)合物[5]。

圖2 LYSO-TRI體系的熒光發(fā)射光譜(T=298 K, λex=280 nm)Fig.2 Fluorescence emission spectra of LYSO-TRI system (T=298 K,λex=280 nm)

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Stern-Volmer方程[6]處理:

式中F0、F分別為無、有TRI時(shí)的熒光強(qiáng)度;τ0為分子熒光平均壽命,約為10-8s;Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù);[L]為TRI的濃度;Kq為猝滅速率常數(shù)。所得數(shù)據(jù)列于表1。LYSO-TRI體系的Stern-Volmer曲線見圖3,可以看出,LYSO的相對(duì)熒光強(qiáng)度F0/F和猝滅劑TRI濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.99以上。曲線斜率即Ksv值列于表1。由表1可知,Ksv隨著溫度的升高而減小及Kq值均大于2.0×1010L·mol-1· s-1[7],都表明TRI對(duì)LYSO的猝滅過程是由反應(yīng)生成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅過程[8]。對(duì)該過程,用公式(3)[9]處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù):

表1 不同溫度下TRI與LYSO的猝滅反應(yīng)參數(shù)Table 1 Quenching reactive parameters of TRIand LYSO at different temperatures

圖3 不同溫度時(shí)的TRI對(duì)LYSO的熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig.3 Stern-Volmer plots for the quenching of LYSO by TRI at different temperatures

式中[Dt]、[Bt]分別為TRI和LYSO的總濃度。由曲線截距、斜率,可得到結(jié)合常數(shù)Ka及位點(diǎn)數(shù)n值,結(jié)果列于表1。由表1可知,LYSO-TRI體系結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約為1,即TRI與LYSO形成1∶1的復(fù)合物;體系的結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度的升高而降低,進(jìn)一步表明TRI與LYSO相互作用方式為靜態(tài)猝滅[10]。

3.2 LYSO-TRI體系作用力類型

LYSO-TRI體系的作用力類型可以由LYSO與TRI反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行推斷,熱力學(xué)參數(shù)由公式(4)、(5)[11]得出:

溫度范圍變化較小時(shí),反應(yīng)的焓變?chǔ)可以看作定值[12],ΔH可以由R ln K對(duì)T-1作圖得到。為了增加ΔH的準(zhǔn)確度,我們又測定了293 K和303 K兩個(gè)溫度的結(jié)合常數(shù)(實(shí)驗(yàn)步驟同2.2節(jié)),計(jì)算結(jié)果見表2。由表2可知,反應(yīng)過程中的ΔG＜0,表明LYSO與TRI的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)的;ΔH＜0,ΔS＞0,表明LYSO與TRI的結(jié)合以靜電作用力為主[13]。

表2 不同溫度下LYSO-TRI體系的熱力學(xué)參數(shù)(λex=280 nm)Table 2 Thermodynamic parameters of LYSO-TRIat different temperatures(λex=280 nm)

3.3 藥物協(xié)同性

蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的協(xié)同性定量分析一般用Hill系數(shù)nH表現(xiàn)出來[14]:

其中,K為結(jié)合常數(shù),Y為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù),nH為Hill系數(shù)。

在熒光實(shí)驗(yàn)中:

式中,1/Qm為以1/Q對(duì)1/[L]作圖的截距。計(jì)算結(jié)果列于表3。由表3可知:溫度分別在298, 310,318 K時(shí),nH值都略大于1,表明TRI與LYSO反應(yīng)后,促進(jìn)了后繼配體與LYSO的作用,但這種效應(yīng)很微弱,即存在較弱的正協(xié)同作用;并且隨溫度的升高,這種正協(xié)同效應(yīng)依次減弱,說明后繼配體隨著溫度的升高較難與LYSO結(jié)合,結(jié)合常數(shù)也就隨著減小[15]。

表3 不同溫度下LYSO-TRI體系的Hill系數(shù)nH(λex= 280 nm)Table 3 Hill coefficient of LYSO-TRI systems at different temperatures(λex=280 nm)

3.4 LYSO-TRI體系的結(jié)合距離

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,能量供體LYSO與能量受體TRI間距離r、能量轉(zhuǎn)移效率E和E是50%時(shí)的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間的關(guān)系[16]:

式中,F0為LYSO的熒光強(qiáng)度;F為LYSO和TRI濃度為1∶1的熒光強(qiáng)度;K2是取向因子,取LYSO和TRI各向隨機(jī)分布的平均值2/3;N為溶劑水的折射率,取有機(jī)物和水的平均值為1.336;Φ為沒有TRI存在時(shí)LYSO的熒光量子產(chǎn)率,取LYSO中Trp的量子產(chǎn)率0.15;LYSO的熒光發(fā)射光譜和TRI的紫外吸收光譜見圖4,陰影部分即重疊積分J;F(λ)、ε(λ)分別為在波長λ處LYSO的熒光強(qiáng)度和TRI的摩爾吸光系數(shù)。由公式計(jì)算得到的E、J、R0、r列于表4。從表4可知r＜7 nm,說明LYSO與TRI間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移,使LYSO與TRI更容易發(fā)生能量的傳遞[17];隨著體系溫度的升高,能量轉(zhuǎn)移效率E減小且結(jié)合距離r增大,使得體系生成的LYSO-TRI復(fù)合物的穩(wěn)定性降低,結(jié)合常數(shù)減小。這進(jìn)一步說明TRI與LYSO之間通過靜態(tài)猝滅方式相互作用[18]。

圖4 LYSO的熒光發(fā)射光譜(λex=280 nm)(1)和TRI的紫外吸收光譜(2),T=298 K,CTRI=CLYSO=8.0× 10-7mol/L。Fig.4 Overlap of the fluorescence emission spectrum of LYSO(λex=280 nm)(1)and the absorption spectrum of TRI(2).T=298 K,CTRI=CLYSO=8.0×10-7mol/L.

表4 不同溫度下LYSO與TRI之間的結(jié)合參數(shù)Table 4 Binding parameters between LYSO and TRI at different temperatures

3.5 LYSO-TRI體系的同步熒光光譜

一般來說,同步熒光光譜可以提供蛋白質(zhì)熒光團(tuán)的微環(huán)境信息,圖5反映的就是LYSO-TRI體系的同步熒光光譜。對(duì)于LYSO而言,Δλ=60 nm僅反映LYSO中Trp殘基的光譜信息,即包括殘基的熒光強(qiáng)度和極性的改變,而Δλ=15 nm反映的是LYSO中Tyr殘基的光譜信息[19]。當(dāng)Δλ=60 nm時(shí),LYSO-TRI體系的Trp殘基的熒光強(qiáng)度隨TRI濃度的升高而減少,進(jìn)一步表明TRI猝滅了LYSO的熒光;但當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),體系的Tyr熒光強(qiáng)度基本不變,這說明TRI作用于LYSO時(shí),Trp殘基幾乎不參與體系的反應(yīng)。另外,由圖5可知發(fā)射峰位置未發(fā)生位移,說明TRI對(duì)LYSO的作用并沒有改變Trp、Tyr殘基所處的微環(huán)境的極性,也就是說LYSO的構(gòu)象并沒有發(fā)生改變[20]。

圖5 LYSO-TRI體系的同步熒光光譜。(a)Δλ=60 nm; (b)Δλ=15 nm。Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of LYSO-TRI system.(a)Δλ=60 nm.(b)Δλ=15 nm.

4 結(jié) 論

TRI以靜態(tài)猝滅方式與LYSO作用并伴有非輻射能量轉(zhuǎn)移,TRI與LYSO反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)均為104數(shù)量級(jí),結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1,表明它們相互作用形成1∶1復(fù)合物。TRI與LYSO間以靜電作用力相互結(jié)合,并且結(jié)合過程中TRI對(duì)后繼配體有較弱的正協(xié)同效應(yīng)。該機(jī)制研究有助于了解溶菌酶作為一種模型蛋白與藥物小分子的作用機(jī)理,有助于了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過程,為藥物的動(dòng)力學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究提供了重要信息。

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Investigation of The Interaction M echanism Between Lysozyme and Trichazol Using Fluorescence Spectroscopic M ethod

LIU Bao-sheng*,HAN Rong,LIZhi-yun,LITong-tong,LIGai-xia

(Key Laboratory ofAnalytical Science and Technology ofHebei Province,College ofChemistry&Environmental Science, Hebei University,Baoding 071002,China)
*Corresponding Author,E-mail:lbs@hbu.edu.cn

The interaction mechanism of trichazol(TRI)to lysozyme(LYSO)at different temperatures(298,310,318 K)was investigated using fluorescence spectroscopy under simulative physiological conditions.The results clearly demonstrated that TRI caused strong quenching of the fluorescence of LYSO by a static quenchingmechanism.The binding constantswere order ofmagnitude of 104and the number of binding site in the interaction was closed to 1.The thermodynamic parameters of LYSO-TRIsystem were determined as follows:negativeΔH and positiveΔS,which indicated that electrostatic interaction played amajor role in the binding reaction.The effectof cooperative binding of TRIwas quantified by Hill's coefficient(nH)and the values of nHwere slightlymore than 1 in the systems,which indicated weakly positive cooperativeness in the interaction of TRIwith LYSO.The binding distance(r)between TRIand LYSO was obtained based on the F?rster nonradioactive resonance energy transfer and r was less than 7 nm.Furthermore,the effect of TRIon the conformation of LYSO was analyzed by using the synchronous fluorescence spectroscopy.

fluorescence spectroscopy;synchronous fluorescence spectroscopy;lysozyme;trichazol;interaction mechanism

劉保生(1963-),男,河北保定人,研究員,1992年于河北大學(xué)獲得碩士學(xué)位,主要從事分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用的研究。E-mail:lbs@hbu.edu.cn

O657.3

A

10.3788/fgxb20153612.1458

1000-7032(2015)12-1458-06

2015-06-21;

2015-10-27

國家自然科學(xué)基金(21375032);河北大學(xué)2014-2015學(xué)年實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(2014037)資助