路易斯安那鳶尾LiPCS1基因克隆和表達分析

田松青，朱旭東，趙沿海，原海燕，顧春筍，黃蘇珍

（1 蘇州農業職業技術學院，江蘇蘇州215008；2 中國科學院 植物研究所南京中山植物園，南京210014；3.南京農業大學，南京210095）

植物絡合素（phytochelatin，PCs）是以谷胱甘肽（GSH）為底物通過植物絡合素合酶（phytochelatin synthase，PCS，包括PC2、PC3等）催化而成［1］，能與重金屬結合成復合體而對重金屬解毒起著重要作用［2－4］。目前植物絡合素合酶基因（PCS）已在擬南芥［5］、小麥［1］、芥菜［6］、大蒜［7］、生菜［8］、百脈根［9］、豆梨［10］、蕃茄［11］、毛白楊［12］和湖北海棠［13］等植物中分離得到，已分離PCS的功能驗證初步證明其在植物重金屬鉛螯合解毒過程起重要作用。過表達小麥絡合素合酶基因（TaPCS1）的木立煙草（Nicotiana glaucaR.Graham）植株大大增加鉛（Pb）耐受性，比野生型植物幼苗根長160%；生長在礦區土壤中的轉基因植株的Pb濃度達1 572mg／kg，是野生型的2倍［14］。Lombi等［15］證明與PCs合成和絡合相關的螯合Pb能增加耐Pb植物的耐性。Pb超富集植物水生蕨類Salviniaminima體內PCs的合成量與Pb積累量有著直接關系，推論植物螯合肽絡合作用是 耐Pb機制之一［16］。香根草（Vetiveriazizanioides）在添加外源PCs 的條件下，體內形成PCs－Pb復合物，根和地上部可以累積到19 800 和3 350 mg／kg［17］。在礦區實地試驗中發現，表達TaPCS1的歐美雜種山楊（Populustremula×tremuloides）品種‘Etrepole’轉基因株系的總生物量及Pb積累量顯著高于對照植株［18］。但是，不同物種植物螯合肽所起的作用差異較大，如PCs在蠶豆Pb耐性中所起作用很小［19］，Pb富集植物礦山生態型東南景天（Sedumalfredii）在Pb脅迫下沒有誘導PCs合成［20］。在Pb 脅迫下金魚藻（CeratophyllumdemersumL.）體內的GSH、Cys有所增加和誘導PC2、PC3螯合肽合成［21］。Gupta等［2］報道GSH（PCs的合成前體）在東南景天Pb 解毒的作用，雖然這一過程沒有任何誘導PCs，這說明GSH在沒有PCs 產生的條件下也能擔任重要的解毒功能。

路易斯安那鳶尾（Louisiana iris）是一類觀賞價值很高的宿根植物，具有一定的吸收和忍耐重金屬Pb的能力［22］，目前相關路易斯安那鳶尾PCS基因的研究尚未見報道，且該基因在重金屬Pb 螯合解毒等中的研究非常有限。本研究測定Pb處理前后根系、根狀莖和葉片中Pb含量變化，探討路易斯安那鳶尾吸收和忍耐重金屬Pb的能力。并利用在轉錄組序列分析和RNA－Seq技術檢測初步篩選出差異表達的易斯安那鳶尾LiPCS1 基因片段，通過RACE技術克隆獲得全長，熒光定量RT－PCR 技術分析其不同時間Pb 處理和組織特異性表達，進一步驗證其富集鉛生長、結構［22］和生理生化［23］特性，為探討路易斯安那鳶尾品種Pb富集耐性的分子機理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為路易斯安那鳶尾品種‘Professor Neil’，由美國引進。試驗于2013年9月在南京中山植物園溫室進行。

1.2 方 法

1.2.1 鉛含量測定 選擇生長一致的路易斯安那鳶尾分株苗，置于50% Hoagland營養液培養，30d后生根達3cm 以上長度后，移栽于2L 塑料盆，換成10% Hoagland營養液。Pb 以Pb（NO3）2形式加入，濃度分別為0、200、400及600 mg／L，重復3次，每周換1 次處理液。處理后1 個月取樣，用HNO3－HClO4消化法和電感耦合等離子體原子發射光譜法（ICP，Perkin－Elmer 3300DV）測定植株體內各部分Pb 含量。采用Excel2010 和SPSS19 軟件對試驗數據進行統計和方差分析，用鄧肯多重比較。

1.2.2 路易斯安那鳶尾LiPCS1基因克隆 （1）總RNA 提取 路易斯安那鳶尾幼苗用1／2 Hoagland營養液水培預培養30d，采集新鮮葉片和根系。根據Trizol plus試劑說明書，用新鮮葉片和根系提取總RNA。

（2）克隆LiPCS1基因中間序列 從路易斯安那鳶尾轉錄組數據中篩選出LiPCS1基因相關序列片段信息（comp152611＿c0＿seq5），根據GenBank中已登錄的PCS同源基因的核苷酸和氨基酸序列，利用Clustal W 軟件在線比對其序列同源性和分析保守區域；利用Primer 5和Oligo 7 軟件根據轉錄組中的信息和網上保守區序列設計中間產物引物（表1）。使用逆轉錄酶合成DNA 第1 條鏈，即cDNA。再以cDNA 經PCR 反應擴增中間片段，擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性40s、50℃退火40s、72℃延伸50s，共32個循環；72℃延伸10min。PCR 擴增得到LiPCS1 基因中間產物并進行電泳切膠回收，然后連接到載體上，轉化后對陽性克隆進行測序。

（3）LiPCS1 基因3′端序列的克隆利用Primer 5和Oligo 7 軟件，根據測序獲得的中間序列設計3′端特異PCR 引物（表1）。采用Clontech公 司 的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3′端序列。

（4）LiPCS1 基因5′端序列的克隆利用Primer 5和Oligo 7軟件，根據測序獲得的中間序列設計5′端正向PCR 引物和反向特異PCR 引物（表1）。采用Invitrogen 公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0試劑盒獲得LiPCS1基因的5′端序列。

表1 基因克隆和qRT－PCR所用引物序列Table1 Primers used for gene cloning and qRT－PCR

（5）序列拼接 采用DNAMAN 軟件對克隆得到的5′端、3′端和中間序列進行首尾拼接，得到LiPCS1基因的全序列。

1.2.3LiPCS1編碼蛋白和生物信息學分析 使用Oligo 7 軟件分析該基因編碼的氨基酸序列。從NCBI數據庫中選取與LiPCS1基因編碼的氨基酸序列blastp相似度大于80%的植物同源氨基酸序列，通過Clustal W 軟件分析LiPCS1 基因編碼的氨基酸序列的保守性，并基于此基因編碼的氨基酸序列、利用MEGA 6軟件中的泊松分布模式構建相似植物的系統樹。采用SOPMA 軟件在線分析LiPCS1基因編碼的蛋白質的二級結構，并通過TMHMM 2.0軟件在線分析該蛋白質的跨膜結構域。將克隆到的LiPCS1基因序列采用MEGA6軟件比對其親緣關系。LiPCS1蛋白保守結構域通過pfam（http：／／pfam.xfam.org）在線分析完成。蛋白質三維結構預測在http：／／swissmodel.expasy.org 上進行，并通過http：／／www.ebi.ac.uk／Inter－ProScan 尋找該類蛋白在不同物種中的分布。

1.2.4LiPCS1 實時熒光定量PCR 收集路易斯安那鳶尾的根、莖、葉和花等不同組織的新鮮樣品各3份，同時選取植株大小和長勢一致的分株苗進行不同時間長度（0、1、3、6、12和24h）鉛（濃度為200 mg／L）的處理，重復3次，處理后收集新鮮的根系和葉片。收集的樣品于液氮中速凍，之后保存于－80 ℃超低溫冰箱備用。使用試劑盒提取上述樣品總RNA，用隨機引物將RNA 反轉錄成cDNA，采用SYBR GREEN 染料法，以UBC 為內參基因，根據已克隆的基因序列用Premier 5.0軟件設計特異性檢測引物（表1），做相對定量檢測。將毛細管置于定量PCR 儀（Roche公司）中，設定熒光采集通道以及讀取熒光步驟，按照以下反應程序進行PCR 反應：94 ℃預變性30s；94 ℃變性20s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30s循環45次，72 ℃單點檢測信號；最后加入溶解曲線程序：95℃0s，60℃15s，95℃0s，連續檢測信號。相對轉錄水平采用2－△△Ct法進行計算。數據處理同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 路易斯安那鳶尾對Pb的吸收

從圖1可以看出，路易斯安那鳶尾根系、根狀莖和葉片Pb 含量隨Pb濃度的增加而增加，并以根系Pb含量最大，葉片最小。根系在低濃度200 mg／L Pb處理時積累量為33 050 mg／kg，與對照差異顯著；而在Pb濃度400和600mg／L 時增加不顯著，600mg／L 時達到最大值（36 255.8mg／kg）。根狀莖在200mg／L Pb處理時與對照差異顯著，在600 mg／L時達到最大（1 665mg／kg），各濃度處理都差異顯著。葉片與根狀莖接近，低濃度時對Pb 積累非常小，在Pb 200mg／L 時僅為64.6mg／kg，沒有顯著差異；在高濃度Pb 600 mg／L 時達到最大值（1 249.8mg／kg），與對照差異顯著。

2.2 LiPCS1基因全長及生物學信息分析

2.2.1 基因全長及編碼蛋白質 擴增到路易斯安那鳶尾LiPCS1基因的中間片段1 151bp（圖2，a）。根據獲得的中間片段序列，設計特異引物，3′－RACE擴增得到343bp 片段（圖2，b）。5′－RACE擴增得到335bp片段（圖2，c）。用DNAMAN 軟件進行序列拼接后得到基因完整序列（圖3），其總長1 683bp，GenBank登錄號為KT347093，其開放閱讀框（ORF）為1 503bp，5′非編碼區76bp，3′非編碼區105bp，預測編碼蛋白質含501aa（圖3）。

與其他植物PCS基因類似，路易斯安那鳶尾LiPCS1基因編碼產物由N 端（4 個氨基酸）、保守區（208 個氨基酸）和C 端可變區（289 個氨基酸）組成，氨基端高度保守，共含18 個半胱氨酸（Cys）殘基，其中含有Cys－56、His－162 和Asp－182等3個必需的氨基酸活性位點，它們組成催化三聯體來起活性作用。C末端具有植物絡合素合酶的重金屬離子傳感器基序C368C369RMTC373VRC376（圖3）。

圖1 Pb脅迫下路易斯安那鳶尾各器官中Pb含量Fig.1 Pb contents in different organs of Louisiana iris with Pb treatment

2.2.2 蛋白結構分析 路易斯安那鳶尾LiPCS1基因編碼蛋白pfam 比對結果顯示，它具有2 個典型的植物絡合素亞家族結構域，該結構域是PCS 蛋白的典型特征結構，表明了克隆的路易斯安那鳶尾LiPCS1所編碼的蛋白為植物絡合素合酶。通過SOPMA 軟件在線對路易斯安那鳶尾LiPCS1進行分析，路易斯安那鳶尾LiPCS1蛋白是由α螺旋、延伸鏈和不規則螺旋等結構元件組成，其中α螺旋占49.50%，延伸連占12.18%，不規則螺旋占38.32%。TMHMM 軟件在線分析LiPCS1蛋白質不具有跨膜結構，不是膜蛋白。在http：／／swissmodel.expasy.org 上利用Automatic Modelling Mode預測了路易斯安那鳶尾LiPCS1蛋白的三維結構，同時與豆梨PcPCS1、擬南芥AtPCS1 和百脈根LjPCS1蛋白的三維結構［10］進行比較，認為這4個蛋白具備類似的空間構架。

2.2.3 蛋白質保守性及進化樹分析 通過NCBI數據庫直接搜索相關PCS1 氨基酸序列及利用LiPCS1序列采用blastp的方法，共從數據庫中篩選出10種同源氨基酸序列：油棕Elaeisguineensis（XP＿010935936.1）、海棗Phoenixdactylifera（XP＿008810429.1）、大蒜Alliumsativum（AAO13809.1）、葡萄Vitisvinifera（XP＿002272237.2）、蓮Nelumbonucifera（NP＿001289777.1）、蓖麻Ricinuscommunis（XP＿002529835.1）、小桐子Jatrophacurcas（XP ＿012085275.1）、甜 橙Citrussinensis（KDO60424.1）、擬南芥Arabidopsisthaliana（NP＿199220.1）和節節麥Aegilopstauschii（EMT23611.1）。利用Clustalw 軟件分析同源氨基酸序列，其氨基酸相似位點占83.1%（圖5中所有彩色部分字母表示氨基酸相似位點），氨基酸完全相同位點占34.0%（圖5中黃色部分字母表示氨基酸完全相同位點）。分析結果同時顯示，PCS1 蛋白N－端氨基酸保守性強，應該是功能區域，C－端氨基酸序列變異性變化較大。PCS普遍存在于微生物、動植物等不同物種中，表明不同物種共有PCS催化合成植物絡合素的這一生物途徑。

圖2 LiPCS1基因PCR 產物凝膠電泳Fig.2 PCR gel electrophoresis of LiPCS1

圖3 LiPCS1基因全長及編碼氨基酸序列Fig.3 The full length of the LiPCS1gene and amino acid sequence

利用MEGA6分析這10種同源氨基酸序列同LiPCS1的進化關系（圖4），反映了PCS1在植物進化方面有一定的親緣關系一致性，如棕櫚科（油棕和海棗）。路易斯安那鳶尾LiPCS1 與海棗和油棕關系最近，與其他植物關系較遠。

2.3 LiPCS1不同組織表達特性分析

分別提取路易斯安那鳶尾根、莖、葉、外花瓣、內花瓣、雄蕊和雌蕊的總RNA，OD260／OD280在1.9～2.0間，表明RNA 純度較好，可進行后續試驗。如圖6所示，LiPCS1不同組織表達量為：內花瓣＞雄蕊＞葉＞莖＞外花瓣＞根＞雌蕊，其中內花瓣最高，與其他組織有顯著差異，雄蕊、葉和莖在同一表達水平，外花瓣、根和雌蕊表達較低，雌蕊最低。

2.4 LiPCS1響應Pb脅迫的表達特性分析

圖4 LiPCS1同其他物種PCS1蛋白的進化分析Fig.4 Phylogenetic relationships between LiPCS1 and other plant PCS1s

鉛處理0、1、3、6、12和24h后，分別提取路易斯安那鳶尾的根系和葉片的總RNA 后，進行熒光定量分析。如圖7所示，路易斯安那鳶尾LiPCS1基因在根系和葉片組織中的轉錄水平不同，在葉片中表達普遍比在根系中表達高。隨著鉛處理時間增加，LiPCS1基因在根系和葉片中表達量都表現出先升高后下降的趨勢，并均在鉛處理3h達到最大值，產生顯著差異，在24h時接近對照。

圖6 LiPCS1在路易斯安那鳶尾各組織中的表達Fig.6 Different expression of LiPCS1in various tissues of Louisiana iris

圖7 路易斯安那鳶尾LiPCS1受不同時間鉛脅迫后的表達模式Fig.7 Different expression patterns of LiPCS1in the leaves and roots of Louisiana iris after different time treatments with Pb

3 討 論

在Pb脅迫條件下，路易斯安那鳶尾‘Professor Neil’的根、根狀莖和葉片，Pb最大吸收量分別達到36 255.8、1 665.0和1 249.8mg／kg，符合鉛富集植物葉片或地上部（干重）含Pb達到1 000mg／kg 以上的條件，說明路易斯安那鳶尾具有一定的吸收和忍耐重金屬鉛的能力。路易斯安那鳶尾為成年分株苗，生物量大，特別是具有粗狀的根狀莖，積累了一定的營養，可能對植株逆境抗性等方面起著十分重要的作用。

重金屬脅迫可誘導植物產生PCs并與之結合形成硫肽復合物，以降低對植物毒害。PCs的活性和植物耐重金屬能力與PCs中的Cys殘基的位置和排列方式關系密切［24－25］。本研究所克隆的路易斯安那鳶尾 LiPCS1 與 AtPCS1［5］、LjPCS1［9］和PcPCS1［10］等編碼蛋白，都含有Cys56、His162和Asp182等3個必需的氨基酸活性位點，它們組成催化三聯體起活性作用。其次，C 末端的CCXXXCXXC基序為植物絡合素合酶的重金屬離子傳感器［26］，也與螯合重金屬離子有關。AtPCS1、LjPCS1和PcPCS1表達蛋白分別表現為C358C359XXXC363XXC366、C368C369RETC373MKC376和C369C370QETC374VKC377，路易斯安那鳶尾LiPCS1 蛋白基序與LjPCS1一致的，這4個蛋白在生物體內可能行使類似的功能。Cys358、Cys359、Cys363和Cys366點突變后的AtPCS1蛋白，在Cd2＋或Zn2＋存在條件下，植物絡合素合成能力下降［26］，從試驗上證明了這一可能。

Ha等［5］研究AtPCS1基因在擬南芥中的表達規律時發現，無論Cd2＋是否存在，AtPCS1 在根部的表達豐度均顯著高于葉片組織。與此略有不同的是，路易斯安那鳶尾LiPCS1在根中的表達豐度低于成熟葉片，表明PCS基因在不同植物之間具有不同的表達模式，葉片是路易斯安那鳶尾LiPCS1基因的主要合成部位，在開花時，內花瓣和雄蕊表達特別高。熒光定量PCR 分析表明，路易斯安那鳶尾LiPCS1基因受重金屬鉛脅迫誘導上調表達，其中在葉中的表達量顯著增加，大于在根中的增加量，這與豆梨PcPCS1［10］、蘿 卜RsPCS［27］和BnPCS1［28］基因的表達特征一致，而與小麥TaPCS1［28］的結果相反，這可能是因為路易斯安那鳶尾屬多年生根莖類水生植物，葉的生命周期只有一個生長季節，新葉不斷代替老葉，進而保持較高的活力。

以上結果表明，路易斯安那鳶尾LiPCS1在保護其免受重金屬鉛毒害的過程中可能起到一定作用，但基因上調的倍數較低，還需構建該基因的過表達載體，轉化擬南芥等植物對其功能進行驗證。

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