丹參SmPI1和SmPI2基因克隆及脅迫表達研究

孔維維，化文平，2，王喆之＊

（1 藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西師范大學 生命科學學院，西安710062；2 陜西學前師范學院 生物科學與技術系，西安710100）

蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor，PI）是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白質，在植物體內廣泛存在。PI能與蛋白酶的活性部位和變構部位結合，抑制酶的催化活性或阻止酶原轉化為有活性的酶［1］，具有防止體內蛋白的不必要降解、調節蛋白代謝及調節蛋白酶的生理活性的功能。此外，PI還可以抑制某些病原微生物及某些昆蟲體內蛋白酶，參與植物體的自然防御［2］。目前對PIs的研究主要集中在植物抗性功能方面。根據作用于酶的活性基團的不同及其氨基酸序列的一致性，自然界中蛋白酶抑制劑被分為4類：絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和酸性蛋白酶抑制劑［3］，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑和巰基蛋白酶抑制劑是在轉基因中應用最廣泛的兩類PI蛋白。自Hilder等［4］將豇豆蛋白酶抑制劑基因轉入煙草并獲得抗蟲轉基因植株以來，蛋白酶抑制劑因具有抗蟲譜廣、害蟲不易產生抗體、對人畜無副作用等優點，已成為除Bt殺蟲晶體蛋白基因外被廣泛用于抗蟲工程的第二大類抗性基因。

丹參（Salviamiltiorrhiza）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，以干燥的根及根莖入藥，具有活血調經、祛瘀生新、鎮靜安神、涼血消癰、消腫止痛等功效，臨床上被用于治療冠心病、心絞痛和月經不調等癥［5－7］。隨著丹參各種藥理作用的廣泛應用，其需求量也逐漸增加。但在其種植過程中，各種病蟲害十分普遍，可造成15%～45%的損失，病蟲害成為了影響丹參質量和產量的重要因素［8－9］。

本研究克隆分析了丹參中的2個蛋白酶抑制劑基因SmPI1和SmPI2，并對其在甘藍黑腐病黃單胞 菌（Xanthomonascampestrispv．Campestris，XC）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）誘導下轉錄水平變化進行了初步分析，為進一步研究丹參的抗蟲抗病機理打下基礎。

1 材料和方法

1．1 材 料

丹參（SalviamiltiorrhizaBunge）種子采自陜西天士力植物藥業商洛有限公司商州藥源基地，于盛有蛭石、草木灰（蛭石∶草木灰＝1∶1）的基質中萌發，在人工氣候箱內培養（寧波，RXZ－500D），光照強度150μmol·m－2·s－1，光周期為光照16h／黑暗8h，溫度（25±2）℃，濕度48%。

RNA 提取試劑盒購自OMEGA 公司；SYBR Green ⅡPremixExTaq、pMD19－T vector和反轉錄試劑盒均購自TaKaRa生物公司；甘藍黑腐病黃單胞菌（Xanthomonascampestrispv．Campestris，XC）和大腸桿菌DH5α均由本實驗室保存。

1．2 方 法

1．2．1 處理方法 培養60d的丹參幼苗分別用5 mmol／L MeJA 溶液和用生理鹽水稀釋至OD600＝0．2的XC菌液進行噴灑處理。具體處理方法見劉梅等［10］。處理后的丹參幼苗繼續放于光照培養箱中培養，并于處理后0、6、12、24、48和72h分別取樣，液氮速凍，－80℃保存備用。

1．2．2SmPI1和SmPI2 基因克隆按照植物RNA 提取試劑盒（OMEGA）使用說明書提取不同處理條件下丹參樣品總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。以總RNA 為模板按照反轉錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit（TaKa－Ra）說明書反轉錄得到cDNA 第一鏈。cDNA 樣品保存于－20℃。

依據本實驗室丹參轉錄組數據庫中基因序列（rsmsxl＿009845．y1．scf，rsmsxl＿012002．y1．scf）采用Premer Premier 5．0軟件在完整ORF 框兩端設計引物2對（表1），以丹參總RNA 反轉錄合成的cDNA 為模板，進行PCR 擴增。PCR 程序為95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；72℃延伸10min。擴增產物經凝膠純化后，連接至pMD19－T vector（TaKaRa）上并轉入大腸桿菌DH5α，而后將陽性克隆送北京華大基因科技有限公司進行測序。

1．2．3 SmPI1和SmPI2蛋白生物信息學分析 利用生物信息學數據庫和在線軟件對SmPI1 和SmPI2蛋白的結構及理化性質進行分析。使用ProtParam tool（http：／／web．expasy．org／protparam／）工具預測蛋白質分子量、等電點、穩定性等。利用在線工具PSORT Prediction、TMHMM－2．0、SignalP－4．1（http：／／psort．hgc．jp／form．html／，http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM－2．0／，http：／／www．cbs．dtu．dk ／services／SignalP／）對SmPI1和SmPI2蛋白的亞細胞定位、跨膜結構域及信號肽進行預測。用在線工具SOPMA（http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿automat．pl？page＝npsa＿sopma．html）和SWISS－MODEL（http：／／swissmodel．expasy．org／）完成蛋白質二級結構和三維結構的分析。多序列比對通過ClustalW 完成。系統進化樹使用MEGA 6．0，以最大似然法（Maximum Likelihood，ML），選用最適算法模型WAG＋G 構建。

表1 實驗所用引物Table 1 The primers used for study

1．2．4 脅迫誘導下SmPI1和SmPI2表達變化

采用Premer Premier 5．0軟件，在已知基因序列內部設計實時熒光定量PCR 引物，引物序列見表1。以適宜濃度樣品cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR 反應，檢 測MeJA 和XC誘導下SmPI1 和SmPI2表達量變化。采用丹參持家基因GAPDH作為內參基因。實時熒光定量PCR 反應程序為95℃預變性3 min；95℃10s，60℃30s，共40 個循環。實時熒光定量PCR 結果采用比較Ct法的相對定量［11］進行處理。

2 結果與分析

2．1 SmPI 1和SmPI 2基因克隆

依據丹參轉錄組數據庫基因序列，采用Premer Premier 5．0 軟件設計引 物（SmPI1－S、SmPI1－R；SmPI2－S、SmPI2－R），通過PCR 擴增從丹參cDNA中克隆得到了2個蛋白酶抑制劑基因（圖1），經測序驗證后分別命名為SmPI1 和SmPI2（GenBank登錄號分別為EF187459．1和EF187460．1）。

2．2 SmPI 1和SmPI 2的序列分析

利用DNAstar軟件對SmPI1和SmPI2 全序列進行分析，發現SmPI1和SmPI2分別含有一個長度為222bp和216bp開放閱讀框，分別編碼73和71個氨基酸。NCBI 中BLAST分析顯示，SmPI1和SmPI2 蛋白與川桑（XP＿010094276．1）、可可（XP＿007009884．1）、苜蓿（XP＿003590799．1）等植物的蛋白酶抑制劑蛋白相似性較高，分別為58%、52%、53%和54%、56%、51%。

絲氨酸蛋白酶抑制劑按照所含有結構域不同可分為Bowman－Birk、Kunitz、馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ（PI－Ⅰ）和 馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ（PI－Ⅱ）等家族［12］。其中馬鈴薯蛋白酶抑制劑（PI－Ⅰ和PI－Ⅱ）是一類創傷誘導型蛋白抑制劑。PI－Ⅰ家族成熟肽分子量約為8kD，只有1個活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶。PI－Ⅱ家族成熟肽的分子量約為12 kD，有2個活性中心，可以同時抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶［13］。用ScanProsite在線工具預測蛋白結構域發現，丹參SmPI1和SmPI2蛋白N 端存在1個馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ的特征性保守序列［FYW］－P－［EQH］－［LIV］（2）－G－x（2）－［STAGV］－x（2）－A（圖2），說明丹參SmPI1和SmPI2蛋白屬于馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ家族成員。用Clustal W 對丹參SmPI1和SmPI2與其他物種中的馬鈴薯蛋白酶抑制劑I氨基酸序列進行多序列比對發現，馬鈴薯蛋白酶抑制劑I家族的特征序列保守性很高。

利用SOPMA 程序對SmPI1和SmPI2氨基酸序列的二維結構進行預測發現，SmPI1和SmPI2蛋白二級結構組成十分相似，分別包含α螺旋21．92%和21．13%，無規則卷曲41．10%和36．62%，伸展鏈20．55%和26．76%，β轉角16．44%和15．49%。用SWISS－MODEL在線對丹參SmPI1和SmPI2蛋白三維結構進行預測發現，SmPI1和SmPI2蛋白三維結構與馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ家族其他成員如水蛭蛋白酶抑制劑（eglinc）、大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑2（CI2）、南瓜絲氨酸蛋白酶抑制劑（CMTI－V）等相似，都含有一個反應位點環（reactive－site loop），這個環可以通過與蛋白酶的活性部位結合從而抑制蛋白酶活性。反應位點環通常由9～10個氨基酸殘基組成，環中包含一個易斷裂位點，即蛋白酶的活性位點［14－17］（圖3）。比對活性中心發現，在各物種中蛋白酶抑制劑的活性位點氨基酸變化較大。丹參SmPI1和SmPI2的易斷裂位點可能為丙氨酸（A50）和精氨酸（R47）。

圖1 丹參SmPI 1和SmPI 2基因克隆電泳結果Fig．1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of the cloned SmPI 1and SmPI 2 M．DL2000；1．SmPI 1；2．SmPI 2

ProtParam tool 預測結果顯示：SmPI1 和SmPI2蛋白分子量分別為7．6kD 和7．84kD，為小分子蛋白。理論等電點分別為3．93和4．85，為酸性蛋白。不穩定系數（instability index（Ⅱ））分別為34．79 和26．53，屬于穩定蛋白。利用PSORT Prediction對SmPI1 和SmPI2 蛋白進行亞細胞定位預測，結果顯示SmPI1 和SmPI2 蛋白都定位于細胞質；用TMHMM－2．0、SignalP－4．1對蛋白質的跨膜結構域和信號肽進行預測顯示，SmPI1 和SmPI2蛋白沒有跨膜結構域，且無信號肽。據此推測，SmPI1和SmPI2蛋白可能是游離于細胞質中發揮作用。從ML進化樹（圖4）明顯看出，聚類結果分為2支，馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ和馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ。在馬鈴薯蛋白酶抑制劑I家族中，丹參SmPI1與大豆（Glycinemax，NP＿001238694．1）親緣關系最近，而SmPI2 與蕎麥（Fagopyrumesculentum，AAB46906．1）親緣關系最近。

圖2 丹參SmPI1和SmPI2與其它馬鈴薯蛋白酶抑制劑I的序列比對結果Fig．2 Multiple alignment of SmPI1and SmPI2with other protease inhibitors

圖3 丹參SmPI1（A）和SmPI2（B）蛋白三維結構預測結果Fig．3 Predicted 3Dstructures of SmPI1（A）and SmPI2（B）in S．miltiorrhiza

圖4 丹參SmPI1和SmPI2蛋白與其它蛋白酶抑制劑系統進化樹Fig．4 Phylogenetic analysis of SmPI1and SmPI2protein with other protease inhibitors

圖5 MeJA 和XC誘導下SmPI1和SmPI2表達量變化Fig．5 The relative expression of SmPI1and SmPI2responsed to MeJA or XC

2．3 MeJA 和XC 誘導下SmPI 1和SmPI 2的表達變化

馬鈴薯蛋白酶抑制劑是一類創傷誘導型表達的蛋白酶抑制劑［13］。馬鈴薯和番茄蛋白酶抑制劑Ⅰ和Ⅱ在植株受到機械損傷或昆蟲傷害后都會在葉片中大量積累［18－19］。為了探究丹參蛋白酶抑制劑SmPI1和SmPI2 對損傷的響應，用逆境信號分子MeJA 和植物病原菌XC 分別對丹參幼苗進行了處理。實時熒光定量PCR 結果（圖5）顯示，在MeJA和XC誘導下，SmPI1 和SmPI2 的表達量都在處理后6h達到峰值，之后逐漸恢復至初始水平，說明該基因受到植物激素MeJA 和病原菌XC的誘導。

3 討 論

馬鈴薯蛋白酶抑制劑I家族的大部分成員都來自于植物，而且其眾多成員普遍與植物的抗逆性相關。Dunse等［20］研究表明，在棉花中共表達馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ和Ⅱ可以顯著增強棉花對昆蟲傷害的抵抗力。在番茄中，蛋白酶抑制劑Ⅰ和Ⅱ會在未成熟的果實中大量積累，以抵御昆蟲、鳥類等的傷害；在果實成熟后迅速消失使果實可食用，從而促進種子的傳播［21］。在遭受機械損傷后，番茄蛋白酶抑制劑Ⅰ和Ⅱ在葉片的積累也會顯著增加［22－24］。丹參蛋白酶抑制劑SmPI1和SmPI2作為馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ家族成員，可能同其他成員一樣在植物抵御損傷、病蟲害等方面發揮作用。

茉莉酸類是與植物抗性密切相關的內源信號分子，參與損傷、病蟲害、干旱和低溫等條件下的多種抗逆反應，也是環境脅迫中驅動植物防御基因表達的重要信號分子［25－26］。在創傷、昆蟲或病菌攻擊時，植物體內內源茉莉酸類物質含量會急劇上升［27－28］。茉莉酸類物質含量的增加會促進一些與環境脅迫相關物質的合成，并且誘導植物防御基因的表達［29］。本研究發現茉莉酸甲酯和植物病原菌XC 都可以迅速誘導丹參蛋白酶抑制劑SmPI1 和SmPI2 的表達，與番茄蛋白酶抑制劑Ⅰ對損傷的響應相似［24］，說明丹參蛋白酶抑制劑SmPI1和SmPI2與丹參的抗性密切相關。推測病原菌XC 傷害可能是通過信號分子MeJA 的傳導來最終誘導蛋白酶抑制劑基因的表達。本研究為進一步研究丹參蛋白酶抑制劑的抗蟲抗病機理奠定了基礎，為生產中增強丹參以及其他農作物的抗逆性，培育優良品系，增加產量有重要的指導意義。

［1］RYAN C A．Proteolytic enzymes and their inhibitors in plants［J］．Annu．Rev．PlantPhysiol．，1973，24：173－196．

［2］CHENG ZH Y（程仲毅），XUE Q ZH（薛慶中）．The structure and regulation of plant proteinase inhibitor genes and their strategy in pest control［J］．ActaGeneticaSinica（遺傳學報），2003，30（8）：790－796（in Chinese）．

［3］ZHANG L（張 莉），WANG D F（汪東風），ZHANG B（張 賓），etal．Advances in the study of protease inhibitors from leguminous plants［J］．SoybeanScience（大豆科學），2006，25（3）：314－319（in Chinese）．

［4］HILDER V A，GATEHOUSE A M R，SHEERMAN S E，etal．A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco［J］．Nature，1987，330（6 144）：160－163．

［5］WANG B Y（王冰瑤），WU X Y（吳曉燕），FAN G W（樊官偉）．Pharmacologic mechanism for protective effects of danshensu on cardiovascular system［J］．ChineseTraditionalandHerbalDrugs（中草藥），2014，45（17）：2 571－2 575（in Chinese）．

［6］LUO C L（羅彩蓮）．The pharmacological effects and clinical application of theSalvia［J］．ChinaModernMedicine（中國當代醫藥），2012，19（12）：11－12（in Chinese）．

［7］LI Q Y（李巧玉），LIU Y（劉 楊），BAO H Y（包華音）．Progress on pharmaceutical effects and chemical constituents ofSalviamiltiorrhizain recent five years［J］．FoodandDrug（食品與藥品），2014，16（2）：145－146（in Chinese）．

［8］WEN J F（文家富）．Investigation and integrated management for main diseases and insect pests onSalviamiltiorrhizain Shangluo［J］．ShaanxiJournalofAgriculturalSciences（陜西農業科學），2009，55（1）：210－211（in Chinese）．

［9］ZHAO K（趙 魁），GUO X H（郭曉恒），SONG J（宋 杰），etal．The present production situation investigation and analysis ofSalvia miltiorrhiza［J］．LishizhenMedicineandMateriaMedicaResearch（時珍國醫國藥），2010，21（9）：2 307－2 310（in Chinese）．

［10］LIU M（劉 梅），SHENG H（生 華），HUA W P（化文平），etal．Cloning and expression analysis of a non－specific lipid transfer protein gene（SmLTP1）fromSalviamiltiorrhizaBunge［J］．PlantPhysiologyJournal（植物生理學報），2011，47（1）：63－68（in Chinese）．

［11］VANDESOMPELE J，DE PRETER K，PATTYN F，etal．Accurate normalization of real－time quantitative RT－PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］．GenomeBiology，2002，3（7）：34－45．

［12］卜慶云．馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ基因PINⅡ2x的克隆及其轉化水稻的研究［D］．南京：南京農業大學，2005．

［13］LIU W G（柳武革），XUE Q ZH（薛慶中）．Proteinase inhibitors and their application in insect－resistant gene engineering［J］．BiotechnologyBulletin（生物技術通報），2000，（1）：23－28（in Chinese）．

［14］BODE W，PAPAMOKOS E，MUSIL D．The high－resolution X－ray crystal structure of the complex formed between subtilisin Carlsberg and eglin c，an elastase inhibitor from the leechHirudomedicinalis［J］．TheJournalofBiologicalChemistry，1987，166（3）：673－692．

［15］WHITLEY M J，LEE A L．Exploring the role of structure and dynamics in the function of chymotrypsin inhibitor 2［J］．Proteins，2011，79（3）：916－924．

［16］LIU J，GONG Y，PRAKASH O，etal．NMR studies of internal dynamics of serine proteinase protein inhibitors：Binding region mobilities of intact and reactive－site hydrolyzedCucurbitamaximatrypsin inhibitor（CMT1）－Ⅲof the squash family and comparison with those of counterparts of CMTI－V of the potato I family［J］．ProteinScience，1998，7（1）：132－141．

［17］OGATA F，MIYATA T，FUJII N，etal．Purification and amino acid sequence of a bitter gourd inhibitor against an acidic amino acid－specific endopeptidase ofStreptomycesgriseus［J］．TheJournalofBiologicalChemistry，1991，266（25）：16 715－16 721．

［18］GREEN T R，RYAN C A．Wound－induced proteinase inhibitor in plant leaves：apossible defense mechanism against insects［J］．Science，1972，175（4 023）：776－777．

［19］GREEN T R，RYAN C A．Wound－induced proteinase inhibitor in tomato leaves：some effects of light and temperature on the wound response［J］．PlantPhysiol．，1973，51（1）：19－21．

［20］DUNSE K M，STEVENS J A，LAY F T，etal．Coexpression of potato typeⅠandⅡproteinase inhibitors gives cotton plants protection against insect damage in the field［J］．PNAS，2010，107（34）：15 011－15 015．

［21］PEARCE G，RYAN C A，LILJEGREN D．Proteinase inhibitors Ⅰand Ⅱin fruit of wild tomato species：Transient components of a mechanism for defense and seed dispersal［J］．Planta，1988，175（4）：527－531．

［22］JOHNSON R，NARVAEZ J，AN G，etal．Expression of proteinase inhibitorsⅠand Ⅱin transgenic tobacco plants：Effects on natural defense againstManducasextalarvae［J］．PNAS，1989，86（24）：9 871－9 875．

［23］WALKER－SIMMONS M，RYAN C A．Immunological identification of proteinase inhibitorsⅠandⅡin isolated tomato leaf vacuoles［J］．PlantPhysiol．，1977，60（1）：61－63．

［24］GRAHAM J S，HALL G，PEARCE G，etal．Regulation of synthesis of proteinase inhibitorsⅠandⅡmRNAs in leaves of wounded tomato plants［J］．Planta，1986，169（3）：399－405．

［25］吳福安，余茂德，程嘉翎．植物誘導抗性的重要信號分子：茉莉酸類［C］／／中國蠶學會第五次全國桑保學術研討會論文集，2004：118－124．

［26］CAI K ZH（蔡昆爭），DONG T X（董桃杏），XU T（徐 濤）．The physiological roles and resistance control in stress environment of jasmonates［J］．EcologyandEnvironment（生態環境），2006，15（2）：397－404（in Chinese）．

［27］MITH?FER A，REICHELT M，NAKAMURA Y．Wound and insect－induced jasmonate accumulation in carnivorousDroseracapensis：two sides of the same coin［J］．PlantBiology，2014，16（5）：982－987．

［28］SHI Y X（石延霞），YU Y（于 洋），FU J F（傅俊范）etal．Relationship between LOX activity and JA accumulations in cucumber leaves induced by pathogen［J］．ActaPhytophylacicaSinica（植物保護學報），2008，35（6）：486－490（in Chinese）．

［29］XU W（徐 偉），YAN SH CH（嚴善春）．The function of jasmonic acid in induced plant defence［J］．ActaEcologicaSinica（生態學報），2005，25（8）：2 074－2 082（in Chinese）．