硝酸鑭和蘭科菌根真菌對鐵皮石斛生理特性的影響

魏 明，楊超英，孔 芳，柴瑞娟

（安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽蕪湖241000）

蘭科菌根（orchid mycorrhizas，OM）是真菌與蘭科植物形成的共生體，共生體雙方互惠互利［1］。真菌菌絲體可侵入到蘭科植物根系細胞內，菌絲體向外延伸到植物根系達不到的基質中，從基質中吸收營養成分，促進植物生長［2－3］。絕大多數蘭科植物在生長發育過程中都能與相應真菌建立共生關系。

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura et Migo）為蘭科石斛屬植物，富含多糖和生物堿等活性成分，是珍稀藥用植物［4］。鐵皮石斛自然繁殖率低，加上人工大量采摘，野生鐵皮石斛已瀕臨滅絕。隨著植物組培技術的發展，鐵皮石斛離體繁殖技術已基本成熟，可以實現工廠化育苗［5－6］；但是組培苗移栽后的成活率較低，且生長緩慢，這和缺少與之共生的真菌有關。有益的真菌能促進蘭科植物的生長發育［7］。菌根技術是目前國際上先進的一種真菌肥料技術，通過菌根技術能極大地提高植物的生長速度和抗逆性，促進植物次生代謝產物的合成［8］。如何提高石斛菌根共生體的形成效率是石斛菌根化栽培的重要問題。

稀土具有重要的生理功能，其可與細胞內的多糖、蛋白質和核酸等形成比較穩定的化合物，從而影響細胞的生理生化代謝過程，提高微生物的生物活性［9－10］。鑭的化學性質很活潑且副作用小。研究表明，硝酸鑭可促進鹽脅迫下小麥幼苗的生長，提高其保護酶活性，降低膜脂過氧化產物含量，增強植物對環境的適應性［11］。硝酸鑭、硝酸鈰等能促進細莖石斛組培苗的生長，提高其生理活性［12］。但關于稀土和OM 菌根真菌的聯合使用對石斛生理特性的影響鮮有報道。我們從野生的石斛中分離出有效菌根真菌，探討稀土鑭和菌根真菌聯合使用對鐵皮石斛生理特性的影響，以期為應用稀土和菌根技術提高藥用石斛的栽培效率及其藥用品質提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 材料和試劑

鐵皮石斛無菌苗由安徽工程大學組培基地提供，菌根真菌為本實驗室從野生金釵石斛中分離的絲核菌（編號OM12），由本實驗室保存。栽培培養基為樹皮和碎石，營養液為MS培養基中的無機營養成分。所有化學試劑均為分析純。

1．2 接種菌劑的制備和試驗設計

將OM12 真菌接種在PDF 液體培養基中，28℃振蕩培養4～6d，得到液體菌劑備用，菌體濃度約為2×106cfu·mL－1。試驗菌根真菌處理設計接種OM 真菌（＋M），接種體積為2 mL 和不接種OM 真菌（－M）兩個水平，硝酸鑭處理設置0、1．0、3．0、5．0和7．0mg·L－1等5個水平，組成10處理組合，每個組合處理重復3次。選生長一致的鐵皮石斛組培苗（苗高3cm 左右）為原始試驗材料，以盆栽的方式進行培養，培養基以樹皮為主輔以小石子。栽種之前，培養基質進行滅菌處理，然后接種菌根真菌，以不接種菌根真菌作為對照（－M），然后分別添加設計濃度的硝酸鑭進行培養，每20d添加1次營養液。培養時間從2013年4月至2013年9月，然后收獲測定相關指標。

1．3 菌根侵染情況測定

每組隨機抽取鮮根30條，參考Biermann等［13］描述的方法測定菌根的形成情況。將根段洗凈除去雜質，用75%的乙醇擦拭表面，無菌水沖洗數次，于培養皿中用解剖刀將根切成2～4cm 長的段，然后放入10%的KOH 溶液中，121℃充分脫色20min，再用無菌水沖洗3次。將沖洗好的材料放入苯胺藍溶液中染色4h（溫度90℃），然后用無菌水沖洗，除去表面的染液，再在堿性雙氧水中脫色8 min。最后調查菌根侵染率，脫色后根段中有藍色部分即表明真菌已成功侵染。

菌根侵染率（%）＝有菌根的根段數／根段總數×100%

1．4 測定指標及測定方法

將石斛鮮藥取出培養基，按根和莖葉分開，分別稱取根部和地上部分的質量。葉綠素含量采用丙酮酸混合液方法提取測定［14］；丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定［14］；可溶性蛋白質含量用考馬斯亮藍G－250染色法測定［14］；多糖含量采用苯酚硫酸法［15］測定。

取1g樣品加入20mL 磷酸鹽緩沖液，在冰浴中研磨，離心后，上清液用于保護酶活性測定。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性分別用SOD 和CAT 試劑盒測定，過氧化物酶（POD）活性用愈創木酚法測定，單位均為U·g－1［16］。

1．5 數據處理與統計分析

所有實驗重復2次，每個水平重復3次，實驗數據采用SAS軟件進行統計分析，實驗結果以平均值附標準差表示。

2 結果與分析

2．1 硝酸鑭對鐵皮石斛菌根侵染的影響

硝酸鑭對鐵皮石斛菌根的形成具有一定的促進作用（表1）。隨著硝酸鑭濃度的增加，鐵皮石斛OM 真菌的侵染率也隨之提高，并當硝酸鑭濃度達到5．0mg·L－1時，侵染率達到最高（92．8%），繼續增加硝酸鑭濃度OM 真菌的侵染率反而顯著降低，但仍顯著高于未添加硝酸鑭處理的侵染率（46．4%）；由于栽培基質經過滅菌處理，所以，未接種的各處理均未發現OM 真菌侵染。由此可見，適當濃度的硝酸鑭有利于OM 真菌的侵染和石斛菌根的發育，過量的硝酸鑭會抑制石斛菌根的發育。

2．2 硝酸鑭和OM 真菌對鐵皮石斛生物量的影響

OM 真菌和硝酸鑭對鐵皮石斛生物量積累具有顯著的促進作用，鐵皮石斛組培苗接菌和硝酸鑭處理后生長比對照組旺盛，苗色濃綠，產生新根多。由表1可知，隨著硝酸鑭濃度的增大，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛根重、莖葉重和總生物量均呈先增后降的趨勢，尤其接種OM 真菌后，根重、莖葉重和總生物量均顯著增加（P＜0．05）；當硝酸鑭濃度為5．0 mg·L－1時，接種OM真菌（＋M）的石斛根重、莖葉重和總生物量均達到最大，分別是未添加硝酸鑭以及未接種對照組（－M）的4．26倍、4．98倍和4．87倍，同時也與該處理最高的菌根侵染率相對應。

2．3 硝酸鑭和OM 真菌對鐵皮石斛葉綠素含量的影響

葉綠素含量在一定程度上反映了植物光合性能強弱。從圖1可以看出，隨著硝酸鑭濃度的增加，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛的葉綠素含量均呈現先增加后降低的變化趨勢，并均在硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時達到最高值，且與未添加硝酸鑭處理相比均顯著增加；在相同硝酸鑭濃度下，接種OM 真菌處理（＋M）始終高于未接種處理（－M）。可見，接種OM 真菌能顯著促進鐵皮石斛幼苗葉綠素含量提高，在接種OM 真菌同時再添加一定濃度的硝酸鑭又能顯著增強這種促進作用，并當硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時效果最佳。

2．4 硝酸鑭和OM 真菌對抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

CAT、POD 和SOD 是活性氧清除系統的重要抗氧化酶。由圖2 可知，同一硝酸鑭水平下，接種OM 真菌鐵皮石斛植株細胞內CAT、POD 和SOD活性均高于未接種OM 真菌植株；鐵皮石斛幼苗CAT、POD和SOD活性對不同濃度的硝酸鑭處理的響應特征是不同的，在0～3mg·L－1之間，CAT（圖2，A）和POD（圖2，B）活性隨硝酸鑭濃度增加而上升，之后又下降；而在0～5mg·L－1之間，SOD的活性隨硝酸鑭濃度增加而上升，之后又下降（圖2，C）。所以，在適量的硝酸鑭濃度下接種OM 真菌能夠提高鐵皮石斛幼苗保護酶活性，增強石斛的抗逆性，促進石斛的生長。

表1 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛生物量Table 1 The biomass of D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

圖1 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛葉綠素含量變化Fig．1 The changes of chlorophyll content in D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

丙二醛是膜脂過氧化的產物，其積累是活性氧毒害作用的體現，由圖2，D可知，隨著硝酸鑭濃度的增加，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛的丙二醛含量均呈現先降低后上升的變化趨勢，并均在硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時達到最低值，且與未添加硝酸鑭處理相比顯著降低；在相同的硝酸鑭濃度下，接種OM 真菌處理（＋M）始終低于未接種處理（－M）。可見，接種OM 真菌能顯著降低丙二醛含量，在接種OM 真菌同時再添加5．0 mg·L－1的硝酸鑭效果最佳。接種OM 真菌和使用適當濃度的硝酸鑭降低了細胞膜脂過氧化程度，有助于膜系統的穩定性，從而提高了細胞的生理活性，促進鐵皮石斛的生長。

2．5 硝酸鑭和OM 真菌對多糖和可溶性蛋白含量的影響

多糖和蛋白質是細胞的基礎代謝產物，細胞內多糖和蛋白質含量體現了細胞的基礎代謝水平。由圖3可知，隨著硝酸鑭濃度的增加，接種（＋M）和未接種（－M）OM 真菌的鐵皮石斛多糖和蛋白質含量均呈現先增加后降低的變化趨勢，并均在硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時達到最高值，且與未添加硝酸鑭相比顯著增加；在相同硝酸鑭濃度下，接種OM真菌處理（＋M）始終高于未接種處理（－M）。可見，接種OM 真菌能顯著促進鐵皮石斛多糖和蛋白質的合成，在接種OM 真菌同時再添加一定濃度的硝酸鑭又能顯著增強這種促進作用，并當硝酸鑭濃度為5．0mg·L－1時效果最好。

圖2 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛CAT、POD、SOD 活性和MDA 含量變化Fig．2 The changes of CAT，POD and SOD activities and MDA content in D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

圖3 硝酸鑭和OM 真菌處理下鐵皮石斛多糖和蛋白質含量變化Fig．3 The changes of polysaccharide and protein contents in D．officinale seedling with lanthanum nitrate and OM fungus treatments

3 討 論

真菌成功浸染是產生菌根效應的基礎，石斛菌根的形成與其根際微生物有關，適宜的根際微生態環境有利于菌根的形成，如土壤中施氮量能顯著影響AM 菌根的形成［17］。菌根真菌對宿主細胞的侵染與菌根真菌的生理活性有關［18］。稀土元素具有重要的生理功能，可以提高微生物的活性［19］，促進石斛菌根的形成。本研究表明，稀土鑭不僅能促進鐵皮石斛的生長，也能提高根際微生物活性；添加適量的硝酸鑭能促進接種OM 真菌對石斛根系的侵染能力，有利于鐵皮石斛菌根的形成，從而使鐵皮石斛生長比較旺盛，苗色濃綠，產生新根多，生物量明顯高于對照組。接種OM 真菌提高了石斛的生長量，可能是菌根的形成擴大了石斛根系的吸收范圍，從而使石斛能吸收更多的營養以供生長。同時，葉綠素是植物光合作用的基礎色素［20］，植物通過葉綠素對光能的吸收、傳遞和轉化來進行光合作用。石斛菌根的形成提高了石斛葉片的葉綠素含量，改變了植物的生長特性，這也可能是接種OM 真菌提高石斛生長量的原因之一。另外，糖和蛋白質是生命的物質基礎，細胞內糖類和蛋白質的含量體現了細胞的生理活性，可溶性蛋白質含量的提高能增強植物的光合能力。菌根的形成有助于碳代謝，提高細胞生理活性和植物適應能力［21］。本研究發現，接種OM 真菌同時添加硝酸鑭提高了細胞內多糖和蛋白質含量，促進了鐵皮石斛中物質的積累，這是石斛植株生物量增加的另一個因素。

植物的抗逆性與防御系統活性密切相關，硝酸鑭和OM 真菌能提高細胞生理活性，細胞代謝旺盛，而它們的聯合使用效果更顯著。有氧呼吸產生了大量的活性氧，加速了氧化脅迫。植物體內存在SOD、CAT 和POD 等活性氧清除酶系統，這些酶協同作用使活性氧產生和清除處于平衡狀態，以維持植物的正常生理代謝［22］。同時，POD 是多功能酶，對植物生長還具有調節作用。MDA 是細胞膜脂過氧化的主要產物之一，其含量高低可以反映植物遭受逆境傷害程度。大量活性氧的產生加速了氧化脅迫，促進了細胞膜脂過氧化反應，產生大量MDA。MDA 的積累與保護酶的活性有一定的相關性，保護酶活性的提高有利于降低MDA 的含量。本研究中，適量的硝酸鑭和OM 真菌均能提高細胞內保護酶的活性，降低MDA 的含量，二者的變化呈現一定的相關性；在同一硝酸鑭水平下，接種OM 真菌的植株細胞內的SOD、CAT 和POD 活性均高于未接種處理，可見，接種OM 真菌再添加適量的硝酸鑭效果更佳。適量的硝酸鑭和OM 真菌的聯合使用能有效防止植株衰老，提高植株的抗逆性和適應性，促進鐵皮石斛的生長。

總之，添加適量的硝酸鑭和接種OM 真菌能明顯改善鐵皮石斛生理特性，適量的硝酸鑭能促進鐵皮石斛菌根的形成，進而提高鐵皮石斛的葉綠素含量、可溶性蛋白質含量以及保護酶活性，降低MDA含量，增強了鐵皮石斛對環境的適應能力，提高鐵皮石斛生物量和多糖等活性成分的積累。本研究結果為今后進一步開展石斛菌根化栽培和稀土菌肥的開發提供了理論依據。

［1］CHEN J（陳 娟），ZHANG L CH（張麗春），XING Y M（邢詠梅），etal．Advances in research on mycorrhizal symbiosis ofDendrobiumorchidaceae［J］．Chin．Pharm．J．（中國藥學雜志），2013，48（19）：1 644－1 648（in Chinese）．

［2］XU L J（徐麗娟），DIAO ZH K（刁志凱），LI Y（李 巖），etal．Eco－physiological functions of mycorrhizal fungi［J］．ChineseJournalofAppliedEcology（應用生態學報），2012，23（1）：285－292（in Chinese）．

［3］BONFANTE P，GENRE A．Plants and arbuscular mycorrhizal fungi：An evolutionary developmental perspective［J］．TrendsinPlant Sci．，2008，13（9）：492－498．

［4］CHEN X M（陳 曉 梅），GUO SH X（郭 順 星）．Advances in the research of constituents and pharmacology ofDendrobium［J］．Natural ProductResearchandDevelopment（天然產物研究與開發），2001，13（1）：70－74（in Chinese）．

［5］XU X R（徐雪榮），YAO Q SH（姚全勝），LEI X T（雷新濤），etal．Development and application of efficient regeneration system forDendrobiumofficinale［J］．ChineseJournalofTropicalAgriculture（熱帶農業科學），2009，29（10）：41－44（in Chinese）．

［6］WEI M，WEI S H，YANG C Y．Effect of putrescine on the conversion of protocorm－like bodies ofDendrobiumofficinaleto shoots［J］．PlantCellTiss．OrganCult．，2010，102（2）：145－151．

［7］ZHENG W（鄭 偉），ZHANG Y W（張云偉），CHEN L Q（陳龍清）．Research advances of mycorrhiza inDendrobium［J］．HubeiAgriculturalSciences（湖北農業科學），2010，49（9）：2 279－2 282（in Chinese）．

［8］JIN H（金 輝），XU ZH X（徐忠祥），CHEN J H（陳金花），etal．Interaction between tissue－cultured seedlingsDendrobiumofficinaleand mycorrhizal fungus（Epulorhizasp．）during symbiotic culture［J］．ChineseJournalofPlantEcology（植物生態學報），2009，33（3）：433－441（in Chinese）．

［9］YAO Y L（姚艷麗），ZHANG X M（張秀梅），LIU ZH H（劉忠華），etal．Effects of lanthanum nitride and cerium nitrate on Pineapple yield and quality and antioxidant enzyme system［J］．ChineseJournalofTropicalCrops（熱帶作物學報），2010，31（8）：1 372－1 376（in Chinese）．

［10］CHEN X P（陳小攀），FENG X J（馮秀娟），SUN F（孫 峰）．Effect of yttrium on activity microbes in soil［J］．EnvironmentalScience＆Technology（環境科學與技術），2013，36（8）：41－45（in Chinese）．

［11］SHI D P（史東平），YANG X（楊 笑），ZHANG Y Q（張永清）．Effects of lanthanum on the growth and physiological characteristic of wheat seeding under salt stress［J］．ActaBot．Boreal．－Occident．Sin．（西北植物學報），2008，28（4）：730－736（in Chinese）．

［12］DUAN X Y（段曉宇），WANG W Q（汪維權），YANG H（楊 紅），etal．Effect of La（NO3）3and Ce（NO3）3on the growth ofDendrobium moniliformeplantletsinvitro［J］．JournalofSichuanAgriculturalUniversity（四 川 農 業 大 學 學 報），2012，30（2）：186－189（in Chinese）．

［13］BIERMANN B，LINDERMAN R G．Quantifying vesicular－arbuscular mycorrhizae：aproposed method towards standardization［J］．New Phyto．，1981，87（1）：63－67．

［14］李合生．植物生理生化實驗原理與技術［M］．北京：高等教育出版社，1999．

［15］WEI M，JIANG ST，LUO J P．Enhancement of growth and polysaccharide production in suspension cultures of protocorm－like bodies fromDendrobiumhuoshanenseby the addition of putrescine［J］．Biotechnol．Lett．，2007，29（3）：495－499．

［16］WEI M（魏 明），YANG CH Y（楊超英），JIANG SH T（姜紹通）．Effect of ultrasonic on the physiological metabolism of cells in suspension cultures of protocorm－like bodies ofDendrobiumhuoshanense［J］．PlantPhysiologyJournal（植物生理學報），2011，47（6）：619－624（in Chinese）．

［17］ZHAO Q H（趙青華），SUN L T（孫立濤），WANG Y（王 玉），etal．Effects of arbuscular mycorrhizal fungi and nitrogen on plant growth，nutrient uptake and tea quality inCamelliasinensis（L．）O．Kuntze［J］．PlantPhysiologyJournal（植 物 生 理 學報），2014，50（2）：164－170（in Chinese）．

［18］LABIDI S，CALONNE M，JEDDI FB，etal．Calcareous impact on arbuscular mycorrhizal fungus development and on lipid peroxidation in monoxenic roots［J］．Phytochemistry，2011，72（18）：2 335－2 341．

［19］YANG R L（楊榮玲），CHEN W D（陳衛東），WU X Y（吳曉玉），etal．Progress on effect of rare earth on growth，mechanism and application of microorganism［J］．JournaloftheChineseRareEarthSociety（中國稀土學報），2005，23（12）：110－115（in Chinese）．

［20］XU B CH（徐博超），ZHOU ZH Q（周志強），LI W（李 威），etal．Physiological and photosynthetic response to different water conditions ofTaxuscuspidateseedlings［J］．JournalofBeijingForestryUniversity（北京林業大學學報），2012，34（4）：73－78（in Chinese）．

［21］GOICOECHEA N，MERINO S，SáNCHEZ－D＇LAZ M．Arbuscular mycorrhizal fungi can contribute to maintain antioxidant and carbon metabolism in nodules ofAnthylliscytisoidesL．subjected to drought［J］．J．PlantPhysiol．，2005，162（1）：27－35．

［22］HE X L（賀學禮），ZHAO L L（趙麗莉），LI Y P（李英鵬）．Effects of AM fungi on the growth and protective enzymes of cotton under NaCl stress［J］．ActaEcologicaSinica（生態學報），2005，25（1）：188－193（in Chinese）．