軟棗獼猴桃葉片光系統Ⅱ活性對不同溫度的響應

王振興，艾 軍＊，陳 麗，范書田，何 偉，秦紅艷，趙 瀅

（1 中國農業科學院特產研究所，長春130112；2 吉林農業大學 園藝學院，長春130112）

軟棗獼猴桃［Actinidiaarguta（Sieb．et Zucc．）Planch．ex Miq．］為多年生落葉木質藤本果樹，主產于中國東北地區，是珍貴的抗寒果樹資源；其果實富含多種營養成分，Vc含量最高可達430 mg／100g，品質風味獨特，除鮮食外還適于加工果酒、果汁、果醬等，是一種發展前景廣的新興果樹［1］。軟棗獼猴桃的原生境多為半陰生環境，空氣濕潤，溫度變化緩和，而在人工栽培條件下由于陽光直射，常使葉片溫度過高，造成葉片傷害，影響植株的生長和正常開花結果。研究軟棗獼猴桃葉片光系統活性對不同溫度的響應，對于揭示軟棗獼猴桃葉片對溫度條件的適應特性，完善栽培措施等具有重要意義。

近年來，葉綠素熒光誘導動力學曲線分析技術（JIP test）已成為研究光合作用特別是原初光化學反應的最有力工具之一［2－5］，它以豐富的信息來反映光系統Ⅱ（PSⅡ）的原初光化學反應和光合機構狀態的變化。源于JIP test的參數對環境脅迫尤其是高溫脅迫非常敏感［6－8］，植物在高溫環境中常常表現為光合作用效率下降，光合電子傳遞受阻。嚴重高溫脅迫還會對放氧復合體、光系統Ⅱ供體側和受體側造成傷害，尤其是對放氧復合體的傷害更為嚴重，導致葉綠素熒光誘導動力學曲線K 點熒光顯著增加［9］。本試驗采用葉綠素熒光誘導動力學曲線分析方法，研究不同高溫處理對軟棗獼猴桃葉片PSⅡ活性的影響，通過比較Fv／Fm和源于O－J－I－P的其它參數對高溫脅迫的敏感性，揭示高溫對PSⅡ反應中心以及電子傳遞鏈不同位點的傷害，分析高溫脅迫引起軟棗獼猴桃光合速率及產量下降的原因，為選育耐高溫品種及擴大其種植區域提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 材 料

試驗于2010年7月在中國農業科學院特產研究所軟棗獼猴桃資源圃中進行，選擇‘魁綠’品種中生長勢、株高和樹齡等相同的植株3株，每株選取大小、生長狀況一致的向陽功能葉片為試驗測定材料。

1．2 高溫脅迫處理及快速熒光誘導動力學曲線的測定

1．2．1 熱脅迫溫度梯度試驗 根據軟棗獼猴桃葉片特性，在王梅等［10］方法基礎上稍作改進。用打孔器在功能葉片上取直徑10 mm 的葉圓片，3 片1組，共5組，置于鋪有濕潤濾紙的小塑料袋中，分別在35、40、44、48和52℃的恒溫水浴中、黑暗條件下熱脅迫5 min。熱脅迫后立即利用英國Hansatech公司生產的植物分析儀Pocket－PEA 進行快速熒光誘導動力學曲線的測定。

1．2．2 熱脅迫時間梯度試驗 將軟棗獼猴桃葉圓片分別置入44和48℃的恒溫水浴中黑暗條件下熱脅迫3、7和10min，熱脅迫后立即利用Pocket－PEA進行快速熒光誘導動力學曲線的測定。

1．2．3 熱脅迫后恢復試驗 將5組軟棗獼猴桃葉圓片分別置入35、40、44、48和52℃的恒溫水浴中、黑暗條件下熱脅迫5min，熱脅迫后在室內26℃、黑暗條件下、水浴中恢復1h。此外，將另外6組軟棗獼猴桃葉圓片分別置入44和48℃的恒溫水浴中黑暗條件下熱脅迫3、7和10min，熱脅迫后在室內26℃、黑暗條件下、水浴中恢復1h。利用Pocket－PEA進行快速熒光誘導動力學曲線的測定。

1．3 JIP－test分析

根據Strasser等［3－4］的JIP－test，對獲得的OJIP熒光誘導動力學曲線進行分析。主要得到以下參數：最大光化學效率（Fv／Fm）＝（Fm－F0）／Fm；K、J、I點的相對可變熒光：Vk＝（FK－F0）／（FM－F0），VJ＝（FJ－F0）／（FM－F0），VI＝（FI－F0）／（FM－F0）；葉片捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA－下游電子受體的概率：ψ0＝（1－VJ）；單位面積有活性的反應中心的數目：RC／CS＝φPo·（VJ／Mo）·（ABS／CS）；單位反應中心吸收：ABS／RC＝Mo（1／VJ）（1／φPo）；捕獲的能量：TR0／RC＝M0·（1／VJ），用于電子傳遞的能量：ET0／RC＝M0·（1／VJ）·ψ0，熱 耗 散 的 能 量：DI0／RC＝（ABS／RC）－（TR0／RC）；以吸收光能為基礎的光化學性能指數：PIABS＝（RC／ABS）［φPo／（1－φPo）］［ψo／（1－ψo）］。

1．4 數據分析

測定的數據采用Microsoft Excel 2003和SAS 6．0進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2．1 熱脅迫對軟棗獼猴桃葉片最大光化學效率的影響

圖1顯示，軟棗獼猴桃葉片最大光化學效率（Fv／Fm）隨溫度升高而逐漸降低。其中，Fv／Fm在35℃～48℃范圍內隨溫度增加的變化不顯著，較35℃時降低0．5%～12．5%；當溫度升高到52℃時開始顯著大幅度降低，較35℃時降低68．6%。

2．2 熱脅迫對快速葉綠素熒光誘導動力學曲線及其參數的影響

從相對可變熒光Vt誘導動力學曲線（圖2，A、B）可以看出，高溫脅迫顯著增加了軟棗獼猴桃葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線中的J相和I相的相對可變熒光Vi和Vj。通過比較相對可變熒光Vt的差值ΔVt發現，高溫脅迫后，如果不經過常溫水浴恢復立即暗適應測定快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，則可以觀察到K 點出現（圖2，D），但如果經常溫水浴恢復后，僅在52℃高溫脅迫下觀察到J點，K點沒有明顯增加（圖2，C）。以上結果說明高溫脅迫后，放氧復合體在脅迫的一定范圍內可以得以恢復。

圖1 黑暗條件下熱脅迫溫度對軟棗獼猴桃葉片PSⅡ最大光化學效率的影響Fig．1 Effects of different temperatures on the maximal efficiency of Fv／Fmin leaves of A．argutain the dark

圖3，A 所示，軟棗獼猴桃葉片在j點和i點的相對可變熒光Vj和Vi隨著脅迫溫度升高而顯著降低，48℃時降到最低，但在52℃時又顯著升高；在高溫脅迫下Vj和Vi隨處理時間的延長而呈逐漸升高的趨勢（圖3，B）。圖3，C顯示，隨著溫度的升高，軟棗獼猴桃葉片相對可變熒光在300μs的值即Vk逐漸上升，在52℃時有顯著的升高；而以吸收光能為基礎的性能指數（PIABS）隨溫度的升高呈現顯著降低趨勢（圖3，D）。

另外，從圖4，A 中可以看出，軟棗獼猴桃葉片捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA－下游電子受體的概率（ψ0）隨著溫度升高而逐漸升高，但在52℃時則顯著降低；隨高溫處理時間延長，ψ0 則逐漸下降（圖4，B）。說明較高溫度或較長的處理時間會對PSⅡ受體側造成嚴重的抑制或傷害。

2．3 高溫脅迫對軟棗獼猴桃葉片PSⅡ能量分配的影響

圖2 熱脅迫溫度和時間對軟棗獼猴桃葉片葉綠素Vt 和ΔVt 曲線的影響Fig．2 The curves VtandΔVton leaves of A．arguta under different high temperatures and stress times

圖3 熱脅迫溫度和時間對K、J、I點的相對可變熒光（Vk、Vj、Vi）和吸收光能為基礎的性能指數（PIABS）的影響Fig．3 Effects different temperatures and different treatment times on ratio of relative variable fluorescence（Vk，Vj，Vi）and performance index（PIABS）

圖4 不同溫度不同處理時間下葉片捕獲的激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中QA－下游的電子受體的概率（ψ 0）Fig．4 Changes in the probability that a trapped exciton moves an electron further than QA－（ψ 0）by trapped exciton of leaf in different temperatures and different times

表1 不同溫度對軟棗獼猴桃葉片葉綠素熒光參數ABS／RC、TR0／RC、ET0／RC、DI0／RC和RC／CS的影響Table 1 Effects of different temperatures on fluorescence parameters of ABS／RC，TR0／RC，ET0／RC，DI0／RC and RC／CS in A．arguta

由表1可看出，受高溫脅迫處理的軟棗獼猴桃葉片單位反應中心吸收的能量（ABS／RC）隨溫度的升高而增加，但捕獲（TR0／RC）和用于電子傳遞（ET0／RC）的能量則先隨溫度升高而增加，但當溫度升高到52℃時則下降。這表明高溫脅迫后導致葉片單位面積部分反應中心失活，有活性反應中心的數量（RC／CS）減少（表1），單位有活性的反應中心被迫接受更多的光能，單位有活性的反應中心的性能有所增加，但高溫仍然會造成單位面積上的光能利用率降低。其原因可能是單位反應中心效率的增加幅度小于單位面積反應中心的數量RC／CS的下降幅度。另外，在52℃高溫時，TR0／RC和ET0／RC 顯著降低，說明電子受體側在更高溫度下才可能受到嚴重的傷害，造成電子傳遞受到抑制，致使每個反應中心激發能耗散增加［11］。

3 討 論

3．1 熱脅迫對軟棗獼猴桃葉片放氧復合體的影響

很多研究表明，電子傳遞鏈供體側的放氧復合體對熱處理特別敏感，在對大麥、蘋果、堿蓬、小麥以及藻類的高溫處理中［12－17］，都觀察到PSⅡ電子供體尤其是放氧復合體受到高溫的抑制和損害，出現明顯的K 點。但Tóth等［18］研究表明，對大麥葉片經短暫的熱處理后，再在室溫中經過較長時間的恢復，則K 點消失。同時，高溫處理的時間不同也會影響K 相的出現，如有的研究處理時間多達180min，這必然會對放氧復合體造成傷害。在本研究中，對軟棗獼猴桃葉片高溫處理后，PSⅡ電子供體側受到抑制，常溫水浴恢復后并沒有觀察到明顯的K 點，這可能由于所用軟棗獼猴桃葉片的特殊性以及熱脅迫處理時間和熱脅迫后的恢復能力等因素造成的，但如果在高溫脅迫后立即暗適應則觀察到明顯的K點，這說明高溫脅迫后放氧復合體在脅迫的一定范圍內可以經過較長時間得以恢復，但如果脅迫溫度很高或脅迫時間很長則會對放氧復合體以及電子受體側造成不可逆傷害。

3．2 熱脅迫對軟棗獼猴桃葉片電子傳遞鏈不同位點的影響

近些年來，一些研究表明，用Fv／Fm來評價光系統活性對脅迫的反應往往是片面的，甚至是錯誤的［6，14，19］。Wen等［3－4］認為Fv／Fm并不能準確地揭示PSⅡ活性的變化，作為潛在的最大光化學效率，它僅僅反映了有活性反應中心對光能的捕獲效率［20］，而源于JIP－test的熒光參數對脅迫反應更敏感［14］。前人研究認為當Vj和Vi上升時，表示電子傳遞鏈受阻，這主要歸因于QA－的積累和PQ 庫氧化還原反應受限［21］。本研究的結果表明，軟棗獼猴桃葉片Vj和Vi隨熱脅迫溫度升高而呈現先降低后升高的趨勢，它們在不同溫度下相對于Fv／Fm都有顯著的變化，而且都在52℃時有較大轉變。這表明對于軟棗獼猴桃而言，只有當溫度上升到一定程度時，PSⅡ受體側電子傳遞才會受到顯著地抑制。同時，ψ0 是對PSⅡ電子傳遞的綜合評價之一，受PSⅡ供體側的電子供應能力和受體側（包括PSⅠ）接收電子的能力制約，其在本研究中呈現先升高后降低的趨勢，同樣表明了軟棗獼猴桃葉片只有受到更高溫度的脅迫時，才會顯著抑制光合電子向QA以后的電子傳遞體繼續傳遞。然而，本研究中Vk則隨溫度升高而緩慢增加，在52℃顯著增加，說明PSⅡ供體側對高溫響應的敏感性高于受體側，其活性隨著溫度的升高逐漸受到抑制。這些結果均表明，在Fv／Fm近似一致的情況下，高溫脅迫對PSⅡ的能量分配已經產生了顯著的影響，電子傳遞鏈的不同位點對不同的溫度有顯著不同的反應，供體側在高溫下受到的傷害較受體側更為嚴重。

綜上所述，高溫脅迫會引起軟棗獼猴桃葉片PSⅡ電子傳遞鏈供體側和受體側受到傷害，但供體側對高溫更加敏感；與JIP－測定的相關參數相比，Fv／Fm不能有效地評價光系統活性對熱脅迫的反應，也不能對PSⅡ的異質性提供全面有效的信息。

［1］ZHAO SH L（趙淑蘭），YUAN F G（袁福貴），MA Y SH（馬月申），etal．Kui Lu－A new cultivar ofActinidiaargutaPlanch［J］．ActaHorticulturaeSinica（園藝學報），1994，21（2）：207－208（in Chinese）．

［2］LI P M（李鵬民），GAO H Y（高輝遠），STRASSER R J．Application of chlorophyll fluorescence dynamics to the study of phytobiology［J］．JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology（植物生理與分子生物學學報），2005，31（6）：559－566（in Chinese）．

［3］STRASSER B J．Donor side capacity of photosystem Ⅱprobed by chlorophyll a fluorescence transients［J］．PhotosynthesisResearch，1997，52（2）：147－155．

［4］STRASSER R J，SRIVATAVA A，TSIMILLI－MICHAEL M．The fluorescence transient as a tool to characterize and screen photosynthetic samples［M］．UK：Taylor and Francis，2000：445－483．

［5］OUKARROUM A，SCHANSKER G，STRASSER R J．Drought stress effects on photosystem I content and photosystem Ⅱthermotoler－ance analyzed using Chl a fluorescence kinetics in barley varieties differing in their drought tolerance［J］．PhysiologiaPlantarum，2009，137：188－199．

［6］TóTH Z Z，SCHANSKER G，GARA G，etal．Photosynthetic electron transport activity in heat－treated barley leaves：The role of internal alternative electron donors to photosystemⅡ［J］．BiochimicaetBiophysicaActa，2007，1 767（4）：295－305．

［7］JIANG C D，GAO H Y，ZOU Q．Leaf orientation，photorespiration and xanthophyll cycle protect young soybean leaves against high irradiance in field［J］．EnvironmentalandExperimentalBotany，2006，55：87－96．

［8］VAN P D R，SWANEPOEL J W，KRüGER G H J．Modulation of photosynthesis by drought in two desert scrub species exhibiting C3－mode CO2assimilation［J］．EnvironmentalandExperimentalBotany，2007，61：124－136．

［9］GEORGIEVA K，TSONEV T，VELIKOVA V，etal．Photosynthetic activity during high temperature of pea plants［J］．JournalofPlant Physiology，2000，157（2）：169－176．

［10］WANG M（王 梅），GAO ZH K（高志奎），HUANG R H（黃瑞虹），etal．Heat stress characteristics of photosystemⅡin eggplant［J］．ChineseJournalofAppliedEcology（應用生態學報），2007，18（1）：63－68（in Chinese）．

［11］姜闖道．高等植物光合作用中的激發能分配及光破壞防御機制［D］．山東泰安：山東農業大學，2003．

［12］OUKARROUM A，SCHANSKER G，STRASSER R J，etal．Probing the responses of barley cultivars（HordeumvulgareL．）by chlorophyll a fluorescence OLKJIP under drought stress and rewatering［J］．EnvironmentalandExperimentalBotany，2007，60：438－446．

［13］CHEN L S，LI P M，CHENG L L．Comparison of thermotolerance of sun－exposed peel and shaded peel of‘Fuji’apple［J］．Environmental andExperimentalBotany，2009，66（1）：110－116．

［14］WEN X G，QIU N W，LU Q T，etal．Enhanced thermotolerance of photosystem Ⅱin salt－adapted plants of the halophyteArtemisia anethifolia［J］．Planta，2005，220（5）：486－497．

［15］MATHUR S，JAJOO A，MEHTA P，etal．Analysis of elevated temperature－induced inhibition of photosystem Ⅱusing chlorophyll a fluorescence induction kinetics in wheat leaves（Triticumaestivum）［J］．PlantBiology，2011，13：1－6．

［16］LU C，ZHANG J．Heat－induced multiple effects on PSⅡin wheat plants［J］．PlantPhysiology，2000，156：259－265．

［17］STRASSER B J．Donor side capacity of photosystem Ⅱprobed by chlorophyll a fluorescence transients［J］．PhotosynthesisResearch，1997，52：147－155．

［18］TóTH S Z，SCHANSKER G，KISSIMON J，etal．Biophysical studies of photosystem Ⅱ－related recovery processes after a heat pulse in barley seedlings（HordeumvulgareL．）［J］．JournalofPlantPhysiology，2005，162（2）：181－194．

［19］LU C，ZHANG J．Effects of water stress on photosystem Ⅱphotochemistry and its thermostability in wheat plants［J］．JournalofExperimentalBotany，1999，50：1 199－1 206．

［20］KRAUSE G H，WEIS E．Chlorophyll fluorescence and photosynthesis：the basis［J］．AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology，1991，42：313－349．

［21］GOVINDJEE．Sixty－three years since Kautsky：chlorophyll a fluorescence［J］．AustralianJournalofPlantPhysiology，1995，22（2）：131－160．