關蒼術花粉母細胞減數分裂及其雄配子體發育研究

樸 錦，具紅光，樸鐘云

（1 延邊大學 農學院，吉林延吉133002；2 沈陽農業大學 園藝學院，沈陽110161）

關蒼術（AtractylodesjaponicaKoidz.ex Kitam）屬菊科蒼術屬多年生草本植物，主產于中國的東北，是吉林省的道地藥材［1］，具有燥濕健胃、祛風濕、明目等功效，能治濕困脾胃、倦怠嗜臥、胸痞腹脹、食欲不振、肢節酸痛、夜盲等疾病［2］。國內外對關蒼術的研究主要集中在化學成分［3－4］、藥理活性［5］、炮制方法［6］及環境因子的影響［7］等方面，對于關蒼術的細胞學研究較少，僅見于王臣［8］、張定成［9］和李俊英［10］的核型分析報道，而關于關蒼術花粉母細胞減數分裂方面的研究鮮有報道。因此，本研究對關蒼術花粉母細胞減數分裂及雄配子體發育過程進行細致觀察，以期揭示減數分裂過程中染色體變化的行為規律，為關蒼術個體世代之間遺傳物質的恒定性、遺傳變異規律、生殖發育過程等細胞遺傳學的深入研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料為菊科蒼術屬的關蒼術，取自延邊大學農學院關蒼術種質資源圃。

1.2 實驗方法

于2014年6月17日早晨6：00～9：00，每隔30 min摘取一次正在生長的不同大小的關蒼術花蕾。采集后立即放入卡諾氏固定液（冰乙酸∶無水乙醇＝3∶1）中固定24h，經95%、80%乙醇各浸泡30min，最后轉入70%乙醇中，置4℃冰箱保存備用。

制片時取出花蕾，用游標卡尺測量其直徑后放在載玻片中央，用解剖針挑出3～5枚花藥，滴1～2滴卡寶品紅于花藥上，用解剖針將花藥橫向切斷，并從一端向切口輕輕擠壓花藥擠出花粉母細胞，然后用鑷子除盡花藥壁等雜物，蓋上蓋玻片。吸除多余染色液后烤片，然后立即用濾紙蓋住，用大拇指輕壓蓋片。鏡檢并將好的片子用中性樹膠封片并攝影。

觀察同花蕾和花藥中減數分裂進程，并拍照保存；分析花蕾大小與減數分裂進程的關系，并統計減數分裂進程中花粉母細胞內出現異常（如雙核仁、落后染色體、染色體橋、染色體片段、微核以及多分體等）情況的頻率。

2 結果與分析

2.1 關蒼術花蕾形態與減數分裂的關系

關蒼術花由許多管狀小花構成頭狀花序，花序外圍有一輪葉狀苞片，總苞片5～8 層（圖1，a、b），花瓣為白色（圖1，c），5 枚連合，子房2心皮下位，花柱1條，伸于花藥管中，頂端柱頭2裂。關蒼術兩性花、雌花異株，兩性花具有聚藥雄蕊（圖1，d、e），開花后能看見淡紫色的花藥，而雌花中則看不到花藥，剝除花瓣后即可看到相互分離的花絲和花藥，但其花藥全部干癟不產花粉（圖1，f）。

減數分裂過程與花蕾直徑存在一定相關性，花蕾直徑約4～5mm 時，關蒼術花粉母細胞進入減數分裂時期，當直徑超過約12 mm，減數分裂已基本結束（表1）。同時還發現同一花蕾中不同花藥，甚至同一花藥內不同花粉母細胞間也存在減數分裂進程的不同步性（圖1，g～k）。

2.2 關蒼術花粉母細胞減數分裂

共觀察前期Ⅰ至四分體時期的1155個細胞，其中異常率為7.71%（表2）。減數分裂各個時期的主要特征如下：

觀察處于前期Ⅰ的299 個細胞，減數分裂正常細胞有294個。處于前期Ⅰ的細胞染色體行為具有如下特點：細線期，核內出現細長如線的染色體，相互緊密纏繞位于細胞一側（圖版Ⅰ，1）；偶線期，染色體較細線期縮短增粗，同源染色體開始聯會，位于細胞中央（圖版Ⅰ，2）；粗線期染色體進一步短縮加粗，1.68%的粗線期細胞出現2個核仁（圖版Ⅰ，3、4）；雙線期染色體螺旋化，縮短變粗，染色體現出“V”、“X”、“O”型等形狀（圖版Ⅰ，5）；終變期染色體更加粗短，形成12對較規則的二價體，多以棒狀、點狀等形式存在（圖版Ⅰ，6），此期二價體在核內均勻分散排列，是核內染色體計數的好時期，關蒼術染色體構型為2n＝14Ⅱ。

中期Ⅰ，核仁消失，二價體排列在赤道板兩側（圖版Ⅰ，7～9），是鑒定染色體數目的最好時期（圖版Ⅰ，7），13.34%細胞存在落后染色體（圖版Ⅰ，10）。

表1 關蒼術減數分裂時期和花蕾直徑的關系Table1 The relationship between several periods of meiosis and diameter of floral bud of A.japonica

圖1 關蒼術花蕾、雄蕊及同一花藥不同時期的減數分裂相（標尺＝12μm）Fig.1 Meiosis－related A.japonica buds，stamens and anthers at different times in the same anther（Bar＝12μm）

表2 減數分裂各時期花粉母細胞數量及染色體異常頻率Table2 Number and frequency of pollen mother cells in each stage of meiosis

后期Ⅰ，在紡錘絲的牽引下，二價體中的兩條同源染色體彼此分離（圖版Ⅰ，11、12），隨機向兩極移動，完成染色體數目減半（圖版Ⅰ，13）。此期4.20%的細胞出現染色體橋（圖版Ⅰ，14）和落后染色體（圖版Ⅰ，15）。

末期Ⅰ，染色體移到細胞兩極后，松散變細，逐漸形成兩個子核，核仁和核膜重新出現（圖版Ⅰ，16）。此期2.42%的細胞存在分裂不同步現象（圖版Ⅰ，17）。

前期Ⅱ，染色體散亂分布，逐漸縮短（圖版Ⅰ，18）。

中期Ⅱ，兩組染色體分別排列在各自的赤道板上（圖版Ⅰ，19），4.00%的細胞出現落后染色體（圖版Ⅰ，20）或產生染色體不同步的現象（圖版Ⅰ，21）。

后期Ⅱ，姊妹染色單體在紡錘絲的作用下分別移向兩極（圖版Ⅰ，22），其中有81.99%的細胞染色體能正常分向兩極，有18.02% 的細胞出現染色體橋（圖版Ⅰ，23）或產生染色體不同步的現象（圖版Ⅰ，24、25）。

末期Ⅱ，到達兩極的四組子染色體解螺旋，濃縮成團，核仁出現，核膜形成，1 個母細胞分裂成4個子細胞（圖版Ⅰ，26），至此減數分裂結束，進入四分體時期。

四分體時期，染色體到達四極，解螺旋，形成隔壁分為四分體，其四分體結構少數為十字型或環型（圖版Ⅰ，27），多為四面體型（圖版Ⅰ，28）。此期表現極為復雜，正常四分體占85.14%，染色體融合（圖版Ⅰ，29、30）、三分體（圖版Ⅰ，31）、五分體（圖版Ⅰ，32）、六 分 體（圖 版Ⅰ，33）等 異 常 現 象 共 占14.87%。隨后，小孢子相互分離，形成4個單核花粉粒（圖版Ⅰ，34），也存在部分花粉粒未能正常發育的現象（圖版Ⅰ，35）。

2.3 關蒼術雄配子體的發育

關蒼術小孢子（單核花粒）初期細胞壁薄，細胞質濃，核位于細胞的中央（圖版Ⅱ，a）。單核花粉粒不斷從周圍吸取絨氈層的分泌物或其降解物，體積增大，柱狀結構上沉積孢粉素，形成花粉外壁（圖版Ⅱ，b），細胞質明顯液泡化，逐漸形成中央大液泡，細胞核被擠向與花粉粒壁的一側，進入單核靠邊期（圖版Ⅱ，c、d）；此后，細胞核在近壁處不均等分裂（圖版Ⅱ，e），形成不同形狀的兩個細胞，圓形狀靠近液泡的即為營養細胞，弧形狀靠近花粉粒壁的為生殖細胞（圖版Ⅱ，f、g）；生殖細胞漸漸伸長，呈紡錘形，再進行1次有絲分裂，形成兩個精細胞，成為3－細胞型花粉粒（圖版Ⅱ，h、i）。關蒼術花粉形成外壁時，有些地方沒有積累壁物質而留有空隙，這些空隙逐漸發育成萌發溝（圖版Ⅱ，g），花粉在柱頭上萌發時花粉管即從此處伸出。

3 討 論

3.1 關蒼術花粉母細胞減數分裂觀察的最佳時期

關蒼術減數分裂的染色體行為在同一花蕾和花藥間均表現出不同步性，特別是花蕾外圍小花的花藥和內部小花的花藥間差異明顯。這種不同步性可以延長關蒼術的花期，避免外部環境（如陰雨、低溫）對散粉的影響而增加授粉幾率，對其種群繁殖有利，是一種適應環境條件的進化表現［11］。關蒼術花粉母細胞減數分裂時期與花蕾大小緊密相關，在花蕾大小為4～12mm 時取樣，可初步判斷其進入減數分裂時期，若想掌握花藥的減數分裂時期，可以此作為取材依據。

3.2 關蒼術減數分裂異常的原因及其與花粉敗育的關系

3.2.1 染色體橋 后期染色體橋是最常見的染色體異常現象，可以作為鑒定是否出現染色體倒位的依據之一［12］。在關蒼術花粉母細胞減數分裂的后期Ⅰ和后期Ⅱ均產生染色體單體橋，其原因可能是在倒位圈內外，非姊妹染色單體之間發生交換，其結果產生雙著絲點染色單體。此雙著絲粒在后期向相反的兩級移動時，兩個著絲粒之間的區段跨越兩級構成后期橋。凡是含有因交換而產生重復－缺失染色體的四分孢子都是敗育的，因此，關蒼術也存在花粉部分敗育的現象。

3.2.2 落后染色體 關蒼術染色體制片中還發現染色體小片段和落后染色體。落后染色體是由于分裂的細胞受到損傷（多半是由于紡錘體被破壞），引起染色體不同步移動或者不移動而造成的，本試驗中多見于分裂中期Ⅱ和后期Ⅱ，這種現象有可能導致關蒼術染色體數目的丟失從而造成部分花粉的敗育。

3.2.3 不均等分離 正常進入減數分裂的細胞在四分體時期有明顯的四個均大的小孢子，被胼胝質壁所包裹，而異常的小孢子母細胞在形成四分體時產生不均等分離而產生三分體、五分體或多分體。這種不均等分離的原因可能有以下原因，一是有的二價體不發生分離，移向同一級；二是單價體的隨機分配；三是發生倒位的雙著絲點染色體被拉向同一級。不均等分離引起的遺傳物質的減少或增加最終導致配子體不育［13］。

3.2.4 減數分裂不同步 關蒼術花粉母細胞的減數分裂末期Ⅰ和中期Ⅱ到達兩級的染色體發生不同步的現象，其原因可能是部分花粉母細胞在減數分裂某一時期發生停滯或推遲造成的，花粉母細胞發育雖不同步，但最后均完成減數分裂形成花粉粒。劉麗琴［14］等也認為減數分裂過程中發生的染色體橋、落后染色體、染色體片段及多分孢子等異常現象與減數分裂的不同步沒有直接的關系。

減數分裂過程中發生的染色體橋、落后染色體、染色體片段及多分孢子等異常現象，會不同程度地導致小孢子中遺傳物質的不均衡而形成沒有育性的

孢子，是造成花粉育性低的重要原因［15］。我們曾采用蔗糖培養法對關蒼術花粉的育性檢測，發現蔗糖濃度為15%，培養溫度25℃時，敗育率為19.6%［16］，其花粉敗育率和減數分裂后期的異常行為比率接近，說明花粉敗育應該有一定的細胞學原因。導致花粉敗育的原因是多方面的，除了細胞學原因，還可能與絨氈層細胞的作用失常、營養不良及外界環境等有關，具體原因有待于進一步研究。

圖版Ⅰ 關蒼術（兩性花）花粉母細胞減數分裂及異常情況（標尺＝12μm）PlateⅠ The Meiosis process of pollen mother cells and abnormal conditions of A.japonica（bisexual flower）（Bar＝12μm）

圖版Ⅱ 關蒼術花粉粒發育過程（標尺＝12μm）PlateⅡ Microdiode development of A.japonica（Bar＝12μm）

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