極危孑遺蕨類中華水韭有性生殖的形態學研究

劉子玥，邢建嬌，路 靖，劉保東

（哈爾濱師范大學 黑龍江省普通高等學校植物生物學重點實驗室，哈爾濱150025）

水韭科（Isoetaceae）是水韭亞門孑遺的原始維管植物，具有孤立的演化路線，在經典分類系統和現代分子系統中都占有特殊的地位，是研究維管植物起源演化、古生態變遷的活化石［1］。全世界約有250種水韭，零散分布在熱帶亞熱帶等北半球地區，不同種類對原產地生境都高度依賴，起源或分布中心尚未查明。中國的水韭資源尚無系統的調查，目前已知的只有5種，而且都是特產種［2］。由于受經濟活動的干擾，近幾十年來迅速衰退，面臨滅絕，都被列為國家一級保護物種［3］。

水韭科都是小型草本植物，野生數量極少，與禾本科（Gramineae）水生植物相似，研究工作歷來都受到取材的困擾［4］，主要成果多集中在生態習性［5］、種類鑒定［6］、形態結構［7］、細胞遺傳［8］、分子系統［9］、生理瀕危［10］等方面，孢粉形態［11］和葉舌結構［7］一直是研究的重點。比較而言生殖研究還很匱乏，主要成果有Isoetes lithophila 早期雌配子體及晚期胚胎的形態描述［12］、孢子萌發及配子體發育都對環境高度依 賴［13］、I．andicola 的 生 殖 方 式 多 樣［14］、I．boliviensis雌配子體中的“分界溝”［15］有著特殊的系統學意義等；在成熟頸卵器形態［16］、精子結構［17］、胚胎特征［18］等領域雖然也有一些深入報道，但都缺乏連續觀察，盡管Huang給出了I．taiwanensis頸卵器的發育模式［19］，而Karrfalt則指出I．andicola 頸卵器的形態與生殖無關［14］等。和真蕨類生殖模式日漸明晰［20］、精細生殖結構不斷發現［21］相比，水韭類有性生殖的一些基本環節尚不明確或存在爭議。

中華水韭（Isoetes sinensis）在長江中下游地區經歷了數億年的生態演化，目前已經近乎滅絕，屬國際極危物種（IUCN－CR）［22］，在生殖模式或生殖機制方面，應該有相應的特點。但迄今為止關于生殖的研究還很少，只有劉虹關于大孢子萌發［23］、劉保東關于人工繁殖［24］、邢建嬌關于幼苗管護等方面的探討［25］，分別指出大孢子的萌發率極低、雌配子體容易敗育、生殖對環境高度依賴等，路靖［16］就雌配子體及胚胎發育進行了連續切片觀察，探討了中華水韭瀕危與生殖障礙的關系，給出了一些系統學觀點，但尚不能確定是有性生殖還是孤雌生殖。此外，尚無雄配子體及精子的研究報道。

生殖生理是種群繁衍的基礎，生殖結構是物種的溯祖形態［26］，生殖模式反映種群對環境的適應能力［20］。珍稀瀕危植物的保護和復壯離不開生殖發育的探索［27］。本實驗首次觀察中華水韭的雄配子體及精子的發育，明確了有性生殖的基本特征，給出頸卵器的發育模式，指出胚胎發育規律，首次報道葉舌原始細胞發生發育的特征，以期為闡明有關系統學意義、生殖生理及其結構性障礙提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 材 料

本實驗所用中華水韭的原產地是浙江省華頂山，由浙江大學丁炳揚教授于1999年采集、2001年贈送，憑證標本保存在哈爾濱師范大學植物標本室（HANU），研究用活材料是劉保東通過其孢子繁殖［24］栽 培 在 哈 爾 濱 師 范 大 學 溫 室（N45°52′06″，E126°32′59″）的第二代成熟植株。

1．2 方 法

中華水韭的孢子采集與雌配子體培養方法與邢建嬌等［25］相同。將發育成熟的小孢子用5% NaCl水溶液消毒4min后充分水洗，及時接種在土壤浸出液半固體培養基上，在培養2～5周內隨時鏡檢，統計雄配子體的發生率，并在倒置顯微鏡下，用微細管吸取游動精子滴加在發育良好的雌配子體頸卵器處。選取不同發育時期的雌雄配子體及胚胎培養材料，分別用常規的半薄切片法和超薄切片法，切片染色后鏡檢拍照。半薄切片用甲苯胺藍染色，采用Olympus－BX53F型顯微成像系統拍照；超薄切片法同曹建國［21］，用Tecmal－g2型透射電子顯微鏡觀察拍照。

2 觀察結果

2．1 雌雄配子體的發育

在接種小孢子培養后2～5周內，雄配子體發育成熟，發生率小于千分之一。每個雄配子體（圖版Ⅰ，1）內發育出4個精細胞和大量的營養物質。精細胞（圖版Ⅰ，2）由細長的精核和多條尾鞭型鞭毛構成，精核橫切面呈圓柱狀，直徑約1．2μm，長10～15μm，鞭毛8～12 條，與精核基本等長，呈典型的“9＋2結構”。培養大孢子20～50d，雌配子體發育成熟（圖版Ⅰ，3），在孢子壁三裂縫開裂處逐漸發育出多個頸卵器，并著生有幾十條管狀透明的單細胞假根。頸卵器多數敗育，在可育的頸卵器基部自下而上依次有1個卵細胞和2個頸溝細胞，三者共同構成一個球狀體（圖版Ⅰ，4），卵細胞的體積占球狀體的一半，各細胞中都含有豐富的營養物質。在雌配子體發育初期，觀察到了串狀排列的大量游離核（圖版Ⅰ，5），近球狀，不均質（圖版Ⅰ，6）。

2．2 頸卵器發育

培養大孢子10d后，在大孢子壁三裂縫處開始發育頸卵器。頸卵器的正常發育過程（圖1）是原始細胞經平周分裂形成初生頸壁細胞和中央細胞；在初生頸壁細胞分裂為4～8個頸壁細胞時，中央細胞經一次橫分裂，形成初生溝細胞和卵細胞；當頸壁細胞由8細胞分裂為16細胞時，初生溝細胞則進行一次橫分裂，形成2個頸溝細胞。頸卵器的腹壁則由卵細胞周圍的配子體營養細胞轉化而來（圖版Ⅰ，7～10）。頸壁細胞常出現分裂紊亂現象，即細胞數量常不及16個（圖版Ⅰ，8），或排列不規則（圖版Ⅰ，7，11～14）。2 個頸溝細胞的大小比例不穩定（圖版Ⅰ，7、8、10），在壁細胞之間常出現質地濃密的空隙（圖版Ⅰ，8～11）。頸壁細胞的不規則分化或不規則排列，常導致頸溝不通（圖版Ⅰ，12～14）。過熟的卵細胞常自然凋亡，頸卵器腹部形成潰敗的空腔，潰敗物或通過頸溝涌至配子體表面（圖版Ⅰ，15）。

2．3 胚胎發育

合子近球形，細胞核中央位，周圍的胞質濃稠，核仁清晰（圖版Ⅱ，1）。其后合子近頸溝側的細胞質開始變濃稠（圖版Ⅱ，2），細胞形態斜縱向延長（圖版Ⅱ，3），并沿短軸方向進行一次細胞分裂（圖版Ⅱ，4），分裂面與頸卵器長軸呈約20°夾角（圖版Ⅱ，5）。2～4細胞胚胎易于停止分裂而老化（圖版Ⅱ，5）。由于子細胞的體積不等（圖版Ⅱ，6）或分裂速度不等（圖版Ⅱ，7、8），自數十個細胞后，胚胎即出現明顯的組織分化，首先是在靠近雌配子體深處的細胞體積變大，胞質變淺，斜向頸卵器端的細胞保持旺盛的分裂能力，首先分化出第一葉原基（圖版Ⅱ，9），由于第一葉原基的快速伸長，雌配子體組織也隨之延長（圖版Ⅱ，10），繼續包圍并保護著幼胚，直到第一根原基發生、大孢子壁幾乎脫落。隨著雌配子體營養的不斷損耗，在基足與配子體間首先出現了“分界溝”（圖版Ⅱ，11）。早在球形胚時期第一葉還沒分化的時候，第一葉的葉舌原始細胞就已經出現（圖版Ⅱ，7），但直到第一葉頂端變綠、具有光合能力時，第一葉的葉舌才開始發育（圖版Ⅱ，12）。

圖1 中華水韭頸卵器發育模式Fig．1 Archegonium development mode of I．sinensis

3 討 論

Bell等［28］指出在真蕨類卵發生過程中，卵細胞和配子體呈越來越分離的狀態，石磊等［29］也曾指出在蕨類植物的卵細胞成熟之后，頸溝細胞、腹溝細胞會發生退化，路靖等［16］認為這種分離現象在中華水韭中也有明顯體現，就目前所知的蕨類植物包括臺灣水韭（I．taiwanensis）［19］，其頸卵器發育都是卵細胞與腹溝細胞為姊妹細胞，2個頸溝細胞為姊妹細胞，即卵細胞與腹溝細胞的關系最近，與頸溝細胞的關系較遠。結合以前的研究結果［16］發現，中華水韭的頸卵器發育模式與上述結論存在明顯不同，即“腹溝細胞”與頸溝細胞是由一個細胞分裂而來的，本研究認為中華水韭不存在腹溝細胞，即中央細胞不再分裂，而是直接轉化為卵細胞，這在云貴水韭（I．yunguiensis）中也有發現。頸卵器既是頸卵器植物胚胎發育的前提條件和基礎結構，也是配子生殖或雌雄結合的唯一場所［30］，如果Karrfalt［14］所觀察到的水韭胚胎的形成與其頸卵器無關，在理論上這種胚胎應該是不定胚，即由雌配子體的營養細胞經過脫分化和細胞分裂而形成的，因為雌配子體的所有營養細胞與卵細胞具有相同的染色體組，應屬于無配子生殖，只是發生的場所不在頸卵器內而已。這從另一個角度證明了水韭類植物的生殖方式具有顯著的特殊性。

配子體和頸卵器對胚胎的位置和方向起到決定作用，胚胎發育模式與重力因素關系甚小［12］。本研究觀察到中華水韭沒有胚柄，合子的第一次分裂方向與I．lithophila［18］基本相同，都出現約20°的夾角，也證實了路靖等［16］的結論，但與北美水韭I．echinospora 合子第一次橫裂不同 ，似乎可以認為中華水韭與I．lithophila的親緣關系可能更近一些。中華水韭胚胎發育顯示第一葉不僅早于第一根發生，而且很早就分化出了葉的特征性結構即葉舌（原始細胞），支持Nayar通過孢子體提出的真蕨類植物根葉優先發生學說［32］，也支持通過胚胎發育提出的真蕨類根葉優先發生理論［33－35］，結合卷柏科（Selaginellaceae）胚胎發生［36］和石松科（Lycopodiaceae）胚胎發生［4］的特點，根葉優先發生的觀點同樣適用于石松類，而且葉的發生為最早。

同樣 是 水 生 蕨 類，水 蕨（Ceratopteris thalictroides）的頸卵器發育良好，很容易受精［21］，而中華水韭與系統演化也相對孤立的原始薄囊蕨紫萁屬（Osmunda）［37］都較難受精，似乎表明在生殖特殊性與演化孤立性之間存在著某種內在的關系。中華水韭在有性生殖方面的瀕危原因可能是：雄配子體發生率極低，雌配子體敗育率很高。前者限制了精子的產量，后者導致受精場所的缺失；由于雌配子體的形態結構和發育環節都較為復雜，其敗育的限制性因素也多種多樣：頸卵器頸壁細胞在數量上和排列位置上都易于紊亂，頸溝不暢通；頸溝細胞生殖輔助功能不完善，容易堵塞受精通道；過熟的卵細胞凋亡后，容易引起雌配子體的局部壞死；雌配子體沒有光合同化能力，存活時間短，如果不能及時受精，容易耗盡營養，即使在后期遇到了受精機會，所剩營養物質也不一定能滿足胚胎發育的要求。

種子植物雌配子體游離核的形態結構、分裂狀態能直接決定配子體是否敗育，而且具有穩定的遺傳特點［38］，本研究只是首次觀察到了中華水韭也有游離核存在，但尚不明確能否繼續分裂，游離核與雌配子體育性的關系尚需進一步研究。

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圖版Ⅰ 1～6．雌雄配子體的發育：1．透射電鏡下的成熟雄配子體縱切面，示精細胞（S）、淀粉粒（ST）和蛋白質（P）；2．透射電鏡下的精細胞橫切面，示精核（SP）和鞭毛（F）結構；3．光鏡下雌配子體頂面觀，示孢子壁（SPO）、頸卵器（A）及假根（R）；4．透射電鏡下的卵細胞（E）和頸溝細胞（N1，N2）的縱切面；5．透射電鏡下雌配子體發育早期的游離核群體；6．透射電鏡下的游離核內部結構。7～15．頸卵器發育：7．幼嫩頸卵器縱切面；8．只有2層頸壁細胞的敗育頸卵器；9．發育完好的頸卵器，示第一頸溝細胞（N1）、第二頸溝細胞（N2）和卵細胞（E）；10．頸溝細胞與壁細胞間形成空腔并充滿濃稠物質，卵細胞（E）發育充分；11．第二頸溝細胞（N2）萎縮；12．第二頸溝細胞（N2）膨脹或分裂；13．敗育的頸卵器群；14．分化紊亂的頸卵器；15．敗育的頸卵器，示過熟卵細胞崩潰解體。PlateⅠ Fig．1－6．The development of male gametophyte and female gametophyte：Fig．1．Vertical section of mature male gametophyte through the Transmission Electron Microscope，spermatid（S），starch（ST）and protein（P）；Fig．2．Transverse section of spermatid through the Transmission Electron Microscope，sperm nucleus（SP）and flagellum（F）structure；Fig．3．Apical view of female gametophytes through the light microscope，sporoderm（SPO），archegonium（A）and rhizoid（R）；Fig．4．Vertical section of egg（E）and neck canal cells（N1，N2）through the Transmission Electron Microscope；Fig．5．Free nuclei in the early development of female gametophyte，observed by the Transmission Electron Microscope；Fig．6．Internal structure of the free nuclei through the transmission electron microscope．Fig．7－15．The development of archegonium：Fig．7．Vertical section of young archegonium；Fig．8．Abortive archegonium just have two layers of neck wall cell；Fig．9．Development of the archegonium，the first neck canal cell（N1），the second neck canal cell（N2），egg（E）；Fig．10．A cavity between neck canal cell and wall cell and full off thick material，egg（E）is fully develop；Fig．11．The second neck canal cell（N2）is atrophy；Fig．12．The second neck canal cell（N2）expand or division；Fig．13．Abortive archegoniums；Fig．14．Differentiation disorders archegoniums；Fig．15．Abortive archegonium，the egg over mature is collapse and disassemble．

圖版Ⅱ 胚胎發育1．受精卵的橫切面；2．合子的細胞質發生變化；3．合子斜縱向伸長；4．合子第一次分裂；5．老化敗育的2細胞胚胎；6．細胞不等分裂的胚胎；7．胚胎中最早出現的葉舌原始細胞（L）；8．胚胎早期的組織分化；9．基足與第一葉原基的早期發育；10．隨幼胚發育而不斷縱向延伸的雌配子體；11．雌配子體中出現“分界溝”，幼胚已經分化出第一葉原基（F）和第一根原基（FR）；12．剛開始發育的第一葉的葉舌（LI）。PlateⅡ The development of embryo Fig．1．Transverse section of zygote；Fig．2．Zygote’s cytoplasm is changed；Fig．3．Zygote elongation towards inclined and longitudinal；Fig．4．Zygote division for the first time；Fig．5．Embryos with 2cell is aging and abortive；Fig．6．The embryo cell is unequal division；Fig．7．The earliest appear about the ligule primitive cell（L）in the embryo；Fig．8．Organization differentiation on the early embryo；Fig．9．Basal foot and first leaf primordium early development；Fig．10．Female gametophytes elongation towards longitudinal as the young embryo development；Fig．11．“Gametophyte－sporophyte junction”appeared from the female gametophytes，while young embryo has differentiated the first leaf primordium（F）and the first root primordium（FR）；Fig．12．The first leaf ligule（LI）just starting to develop．