抗黑色素瘤藥物異甘草素對酪氨酸酶抑制機理的研究

龐得全,王英曼,鄭維國,戴云飛

(1.河北聯合大學附屬醫院 放療科，河北 唐山 063000；2.河北聯合大學附屬醫院 血液科，河北 唐山 063000；3．河北聯合大學附屬醫院 急診科，河北 唐山 063000)

?

抗黑色素瘤藥物異甘草素對酪氨酸酶抑制機理的研究

龐得全1,王英曼2,鄭維國3,戴云飛1

(1.河北聯合大學附屬醫院 放療科，河北 唐山 063000；2.河北聯合大學附屬醫院 血液科，河北 唐山 063000；3．河北聯合大學附屬醫院 急診科，河北 唐山 063000)

目的 探討黑色素瘤藥物異甘草素對酪氨酸酶的抑制作用機理。方法 采用酶抑制動力學方法，研究異甘草素對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制作用和抑制動力學，研究甘草素對黑色素瘤細胞A375生長的抑制作用。結果 異甘草素對單酚酶和二酚酶都有良好的抑制作用，IC50分別為(11.22±0.92) μM和(48.53±4.75) μM，且異甘草素是一種可逆的競爭型酪氨酸酶二酚酶抑制劑，抑制常數Ki為(12.14±0.54) μM。異甘草素能顯著抑制黑色素瘤細胞A375的生長，酪氨酸酶活性和黑色素含量不斷降低。結論 異甘草素是良好的酪氨酸酶抑制劑，能抑制黑色素瘤細胞的生長。

異甘草素；酪氨酸酶；黑色素瘤；抑制

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一種結構復雜的多亞基的含銅氧化還原酶[1]，廣泛存在于動植物體，是動植物體酶促褐變、體內色素合成的關鍵酶和限速酶[2]；它具有單酚酶的活性，能將酪氨酸羥化，產生L-多巴(鄰位二羥基苯丙氨酸)，也具有二酚酶的活性，能將L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌很不穩定，可以經一系列的非酶促反應后，形成黑色素(5,6-二羥吲哚和5,6-二羥吲哚-2-羧酸單元構成的異聚體)[3]；但當人體酪氨酸酶的活性過度表達的，則容易引發雀斑、黃褐斑、老年斑以及黑色素瘤等。

異甘草素(isoliquiritigenin)屬于異黃酮類化合物，大量存在于豆科植物甘草的根、豆芽、鷹嘴豆的幼苗、紅芪、黃芪、滇黃精的根、串果藤、香殊蘭的球莖等[4-8]。異甘草素具有較強的抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等生物活性。抗腫瘤作用是近年來研究的熱點。本研究旨在通過探討異甘草素對酪氨酸酶的抑制機理，為其治療皮膚癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人惡性黑色素瘤細胞株A375來自上海中科院細胞生化所。

1.2 試劑 MTT、Triton X-100 (美國Amresco公司)；RP-MI 1640培養基 (美國INVITROGEN 公司)；酪氨酸酶[3610 U/mg，來源于蘑菇，Sigma-aldrich(上海)貿易有限公司]；胎牛血清、異甘草素(分析純)、左旋多巴(L-DOPA，分析純)和L-酪氨酸(L-Tyr,分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；緩沖體系為pH 6.8的磷酸鹽 (50 mmol/L)。

1.3 實驗儀器 UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；Millipore Simplicity水純化系統(法國密理博公司)；培養箱(力康生物醫療科技控股有限公司)；pHs-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性的測定:不同濃度異甘草素(0、50、100、250、200、250、300 μM)分別和酪氨酸酶單酚酶和二酚酶在37 ℃，磷酸鹽緩沖體系中下孵化3 h，分別對應加入L-Tyr和L-DOPA，利用紫外-可見分光光度計的動力學/時間軟件測定475 nm[9]處吸光值隨時間的變化，并通過關系式：相對活性(%)=(R/R0)×100%，計算異甘草素對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制活性；式中R0為無抑制劑時吸光度變化的斜率，R為在不同濃度異甘草素的體系中吸光度變化的斜率。曲酸為陽性對照。

1.4.2 異甘草素對酪氨酸酶二酚酶的抑制動力學研究：在上述實驗條件下，固定酪氨酸酶二酚酶的濃度(2 μM)，測定不同異甘草素濃度(0、 5、10、50、100 μM)條件下，底物濃度對酶催化速率的影響，根據Lineweaver-Burk雙倒數圖，計算并評估異甘草素對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用類型，最終求出抑制常數Ki。

1.4.3 異甘草素對人惡性黑色素瘤A375的生長抑制試驗[10]：把不同濃度(0、50、100、150、200 μM)的異甘草素和人惡性黑色素瘤A375混合，在37 ℃，5%CO2中孵育48 h，之后加入0.5%的MTT染色液50 μL，繼續孵育4 h后，2500 r/min，離心30 min，棄培養基，加入150 μL DMSO溶液，振蕩器混勻后，測定570 nm處的吸光值(OD值)，計算細胞相對存活率。在加藥培養48 h的細胞中，加入磷酸緩沖液和底物L-DOPA，于475 nm處測定黑色素瘤細胞中酪氨酸酶活性；加藥培養48 h的細胞離心取上清，于475 nm處測定黑色素瘤細胞中黑色素生成量。

2 結果

2.1 異甘草素對酪氨酸酶的抑制作用 異甘草素的分子結構式見圖1。

圖1 異甘草素的分子結構式Fig.1 Structure of isoliquiritigenin

隨著異甘草素濃度的增加(0～300 μM)，單酚酶(b)和二酚酶(a)的相對活性不斷降低，當異甘草素濃度達到100 μM時，其對2種酶的抑制能力趨于平緩，解析其對單酚酶和二酚酶的半數抑制濃度(IC50)分別為(11.22±0.92) μM和(48.53±4.75) μM，見圖2。圖3為異甘草素對酪氨酸酶單酚酶的延滯時間結果，結合圖2可知，隨著異甘草素濃度的增加，單酚酶活力逐級下降，而遲滯時間穩步上升。

圖2 異甘草素對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of isoliquiritigenin on monophenolase and diphenolase of tyrosinase

圖3 異甘草素對酪氨酸酶單酚酶延滯時間作用Fig.3 The time delay effect of isoliquiritigenin on monophenolase of tyrosinase

2.2 異甘草素對酪氨酸酶二酚酶抑制動力學研究 為進一步驗證異甘草素對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用類型，分析異甘草素對酪氨酸酶二酚酶的抑制動力學，利用Lineweaver-Burk雙倒數作方程，得出異甘草素對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用類型為競爭型抑制作用[11]，并求得抑制常數Ki為(12.14±0.54) μM，見圖4。

圖4 異甘草素對酪氨酸酶二酚酶的抑制動力學雙倒數曲線c(異甘草素)(μM), 從下向上1-5：0, 5, 10, 50, 100 μMFig.4 The inhibition of isoliquiritigenin on diphenolase of tyrosinase with the Lineweaver-Burk plot c(isoliquiritigenin)(μM), from 1 to 5 were 0, 5, 10, 50, 100 μM

2.3 異甘草素對人黑色素瘤細胞A375的影響 隨著異甘草素濃度的不斷增加，A375生長抑制不斷地增強，A375細胞中的酪氨酸酶活性和黑色素含量不斷降低，當異甘草素的濃度達到100 μM時，異甘草素對A375細胞的生長抑制作用趨于穩定，見圖5。酪氨酸酶的抑制效果與體外實驗結果一致，細胞合成黑色素的能力也呈現下降趨勢，符合酶催化規律。

圖5 異甘草素對人黑色素瘤細胞A375的生長抑制作用Fig.5 Effect of isoliquiritigenin on human melanoma A375 cell

3 討論

惡性黑色素瘤是一種具有多發性、易轉移的惡性程度極高的皮膚癌，到目前為止，并無有效的藥物治療，臨床使用的藥物仍是以化學合成藥物為主，這些藥物在對腫瘤細胞起到殺傷作用同時，也會對人體的正常細胞產生很大毒性，嚴重影響人體其他器官的正常生理代謝。因此篩選低毒性的天然活性成分作為抗癌藥物，越來越受到人們的青睞。本文研究表明，異甘草素對人黑色素瘤細胞A375的生長起到抑制作用，且異甘草素對酪氨酸酶的抑制作用具有濃度依賴性。本研究結果還發現異甘草素能夠使單酚酶穩定態活力逐級下降，遲滯時間穩步上升，這意味著異甘草素可以逐漸干擾酪氨酸與還原態酶的結合，使實驗手段達到檢測限的時間變長。

Lineweaver-Burk雙倒數圖顯示異甘草素對酪氨酸酶二酸酶是典型的競爭性抑制劑，這表明異甘草素可能會結合到酪氨酸酶的Cu離子活性中心，和底物競爭活性位點，從而達到抑制的效果。國內外研究表明[9,12-14]，抑制劑對疾病有關的酶的抑制作用在呈現可逆的競爭性作用時，可以根據酶活性高低，通過有效控制抑制劑藥物的劑量，來高選擇性、可逆地降低酶的活性，而不是使酶徹底失活引起其他不良反應。在本研究中異甘草素是典型的競爭性抑制劑，這表明異甘草素可能會以非共價力，高選擇性的結合到酶地活性中心，與底物可逆競爭活性位點，從而達到抑制效果。

[1] Yoshimori A,Oyama T,TakahashiS,et al.Structure-activity relationships of the thujaplicins for inhibition of human tyrosinase[J].Bioorg Med Chem,2014,22(21):6193-6200.[2] Chiari ME, Vera DM,Palacios SM,et al.Tyrosinase inhibitory activity of a 6-isoprenoid substituted flavanone isolated from Dalea elegans[J].Bioorg Med Chem,2011,19(11):3474-3482.

[3] Wang YJ,Zhang GW,Yan JK,et al.Inhibitory effect of morin on?tyrosinase:Insights from spectroscopic and molecular docking studies[J].Food Chemistry,2014,163(22):226-233.

[4] Chin YW,Jung HA,Liu Y,et al.Antioxidant constituents of the roots and stolons of licorice (Glycyrrhiza glabra)[J].J Agric Food Chem,2007,55(12):4691-4694.

[5] Gong H,Zhang BK,Yan M,et al.A protective mechanism of licorice (Glycyrrhiza uralensis):Isoliquiritigenin stimulates detoxification system via Nrf2 activation[J].J Ethnopharmacol,2015,162(3):134-139.

[6] Zhao ZL,Park SM,Guan LX,et al.Isoliquiritigenin attenuates oxidative hepatic damage induced by carbon tetrachloride with or without buthionine sulfoximine[J].Chem-Biol Interact,2015,225(1):13-20.

[7] Wong YT,Lin SM,Poon CH,et al.The licorice flavonoid?isoliquiritigenin reduces DNA-binding activity of AhR in MCF-7 cells[J].Chem Biol Interact,2014,221(19):70-76.

[8] Zhao H,Zhang X,Chen X,et al.Isoliquiritigenin,a flavonoid from licorice,blocks M2 macrophage polarization in colitis-associated tumorigenesis through downregulating PGE2 and IL-6[J].Toxicol Appl Pharmacol,2014,279(3):311-321.

[9] Hu YH,Liu X,Jia YL,et al.Inhibitory kinetics of chlorocinnamic acids on mushroom tyrosinase[J].J Biosci Bioeng,2014,117(2):142-146.

[10] Fabrizio A,Alice F.Liposomes and MTT cell viability assay:An incompatible affair[J].Toxicol in Vitro,2015,29(2):314-319.

[11] Yan JK,Zhang GW,Hu YT,et al.Effect of luteolin on xanthine oxidase:Inhibition kinetics and interaction mechanism merging with docking simulation[J].Food Chem,2013,141(4):3766-3773.

[12] Brindis F,Rodríguez R,Bye R,et al.(Z)-3-Butylidenephthalide from Ligusticum porteri,an α-Glucosidase Inhibitor[J].J Nat Prod, 2011,74(3):314-320.

[13] Zhan C,Gu B,Xie C,et al.Cyclic RGD conjugated poly(ethyleneglycol)-co-poly(lactic acid) micelle enhances paclitaxel anti-glioblastoma effect[J].J Control Release,2010,143(1):136-142.

[14] Hegi ME,Diserens AC,Gorlia T,et al.MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma[J].N Engl J Med,2005,352(10):997-1003.

(編校：吳茜)

Study on inhibitory mechanism of anti-melanoma drug isoliquiritigenin on tyrosinase

PANG De-quan1, WANG Ying-man2, ZHENG Wei-guo3, DAI Yun-fei1

(1.Department of Radiotherapy, Hebei United University Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China; 2.Department of Hematology, Hebei United University Affiliated Hospital,Tangshan 063000, China; 3.Department of Emergency, Hebei United University Affiliated Hospital, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of soliquiritigenin on tyrosinase.MethodsThe inhibition effect and inhibitory kinetics of tyrosinase induced by oliquiritigenin were investigated.The effect of isoliquiritigenin on A375 melanoma cell were preliminarily indicated.ResultsThe inhibitory effect of isoliquiritigenin on monophenolase and diphenolase of tyrosinase was good, IC50was (11.22±0.92) μM and (48.53±4.75) μM, isoliquiritigenin was a competitive inhibitor, the value of inhibition constant (Ki) was (12.14±0.54) μM.Isoliquiritigenin could inhibit the prolifevation of A375 cell significantly, and the tyrosinase activity and melanin synthesis decreased.ConclusionIsoliquiritigenin as a tyrosinase inhibitor, plays an important role in the regulation of melanin, which provides the theoretical basis for the clinical anti skin cancer.

isoliquiritigenin; tyrosinase; melanoma; inhibitory mechanism

河北省科技廳科研項目(112761175)，唐山市科技局指令性計劃(12140209A-30)

龐得全，男，博士，副主任醫師，研究方向：腫瘤放射治療和綜合治療，E-mail：pangdequandoc@163.com。

R453.9

A

1005-1678(2015)03-0045-03