骨保護(hù)素對破骨細(xì)胞的影響程度分析

劉建,宋暉

(1.山東東營市勝利油田醫(yī)院 骨科，山東 東營 257000；2.山東大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000)

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骨保護(hù)素對破骨細(xì)胞的影響程度分析

劉建1,宋暉2

(1.山東東營市勝利油田醫(yī)院 骨科，山東 東營 257000；2.山東大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000)

目的 通過分析比較不同濃度的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)對破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)活性的影響程度來研究2者在生理活性及生理功能之間的相關(guān)性。方法 應(yīng)用6周齡的雌性小鼠，取骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)，添加不同濃度的骨保護(hù)素(10、20、50、100 μg/L)后通過抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色、細(xì)胞骨架F-actin染色及骨吸收陷窩的檢測，觀察OPG與OC之間的相關(guān)性。結(jié)果 OC培養(yǎng)1 h內(nèi)即貼壁生長，并為展開且無大的多核OC存在。培養(yǎng)至第5天，較小的單核細(xì)胞逐漸開始相互融合，形成多核細(xì)胞且特征明顯。OPG處理3 d后，隨著OPG 濃度的增大，實(shí)驗(yàn)組多核細(xì)胞數(shù)隨著骨保護(hù)素(OPG)濃度的逐漸增加而減少，2者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-0.516，P<0.05)，且OPG濃度為50 μg/L時僅有少量多核細(xì)胞可見。OPG的濃度為20、50 μg/L時，OPG組的OC數(shù)較對照組顯著減少(P<0.05)，而當(dāng)OPG的濃度為100 μg/L時，OPG組的OC數(shù)較對照組呈極顯著減少(P<0.01)。OPG實(shí)驗(yàn)組的骨吸收陷窩的面積、密度和減弱程度均與OPG的濃度呈正相關(guān)(r=0.459；r=0.426；r=0.389，均P<0.05)，且OPG各濃度組骨吸收陷窩面積與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 不同濃度的OPG對破骨細(xì)胞功能及活性的影響程度不同，且OPG的濃度越大其抑制性越強(qiáng)。

骨保護(hù)素；破骨細(xì)胞；吸收陷窩

破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)來源于特定的破骨前體(osteoclast precursors，OCPs)，在骨吸收功能中維持至骨代謝平衡，且與全身或局部性的骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[1]。研究表明[2]，骨營養(yǎng)不良的最主要原因?yàn)楣俏粘潭却笥诠窃诮ǔ潭龋@也間接說明了破骨細(xì)胞對骨質(zhì)的影響較大。此外，OC活性的異常變化可對機(jī)體骨骼產(chǎn)生不同程度的病理性變化，如骨質(zhì)疏松等。近些年發(fā)現(xiàn)[3]OPG可以通過OPG/RANK/RANKL機(jī)制抑制OC的分化、活化成熟并誘導(dǎo)OC的凋亡，且有望成為治療多種骨代謝疾病的理想藥物。但當(dāng)前國內(nèi)外對于骨保護(hù)素與破骨細(xì)胞之間的活化影響成對的報道較少，且其中關(guān)于活化和生成的機(jī)理尚不明確。故本試驗(yàn)通過對不同濃度的骨保護(hù)素對破骨細(xì)胞的生成和活化程度的影響來研究兩者在生理活性及生理功能之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 超凈工作臺(北京精密儀器廠)；PS-9000705超純水裝置(美國 LABCONCO 公司)；CO2溫培養(yǎng)箱(Heraeus公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司：IX 7000) ；掃描電子顯微鏡(日電，JEOL JSM-T300)。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒購自美國Sigma公司；α-MEM(Gibco)；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司)；1600鋸式切片機(jī)(Leica)；12、48孔培養(yǎng)板(興萬Corning)；牛皮質(zhì)骨片(直徑50 μm，IDS)；骨保護(hù)素(PeproTech Inc.USA)。

1.2 OC分離與培養(yǎng) OC分離在參考付應(yīng)宵[4]的分離方法上做出一定的改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)選取6周齡的雌性ICR小鼠，使其脫頸窒息而死，將小鼠的前肢肱骨及后肢長骨在無菌環(huán)境下進(jìn)行分割分離，取骨髓細(xì)胞并于200 g/min下離心5 min，取沉淀物。重懸于含α-MEM的培養(yǎng)液中(含2 mmol/L L-谷氨酰胺，10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素)，按操作規(guī)程要求將其分別接種于12孔培養(yǎng)板和48孔培養(yǎng)板，其中在48孔板中部分放置牛骨片，同時在5%CO2飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。貼壁細(xì)胞用37 ℃含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，繼續(xù)培養(yǎng)，每天更新培養(yǎng)液。如此反復(fù)操作3 d。第4天，其中對照組加入0 μg/L的OPG，實(shí)驗(yàn)組加入10、20、50和100 μg/L的OPG，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，進(jìn)行檢測。

1.3 染色處理 經(jīng)骨保護(hù)素(OPG)處理3 d后，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，用含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，然后以4%多聚甲醛固定10 min，使用TRAP試劑盒進(jìn)行檢測。將玻片取出，用枸櫞酸/Acetone溶液進(jìn)行固定后進(jìn)行染色，使其在37 ℃的環(huán)境下孵育60 min，清洗、晾干、封片，倒置顯微鏡觀察。

培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，再次以含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，0.1% triton X-100透膜處理5 min，含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，1%牛血清白蛋白封閉30 min。嚴(yán)格按照說明書用Phalloidin-TRITC(50 mg/L)進(jìn)行染色，在37 ℃的環(huán)境溫度下避光孵育20 min，含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，熒光顯微鏡觀察。

1.4 牛皮質(zhì)骨片吸收陷窩檢測 將牛皮質(zhì)骨片加入48孔培養(yǎng)板中，與細(xì)胞共同培養(yǎng)8天。將玻片取出，以含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，用0.25 mol/L的NH3·H2O溶液超聲清洗3次，每次5 min，保證其可以將吸收陷窩被完全暴露出來。細(xì)胞被完全清除后，乙醇梯度脫水，丙酮置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴鍍儀噴鍍鍍金。掃描電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 OC形態(tài)學(xué)觀察 OC培養(yǎng)1h內(nèi)即貼壁生長，為展開且無大的多核OC存在。OPG處理2d后，較小的單核細(xì)胞逐漸開始相互融合，形成多核細(xì)胞且特征明顯。OPG處理3 d后，見圖1。對照組細(xì)胞形態(tài)整體良好，實(shí)驗(yàn)組多核細(xì)胞數(shù)隨著骨保護(hù)素(OPG)濃度的逐漸增加而減少，2者間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r=-0.516，P<0.05)。且當(dāng)骨保護(hù)素(OPG)濃度為50 μg/L 時，視野內(nèi)僅存在少量多核細(xì)胞。

圖1 OC形態(tài)學(xué)觀察(×100) a.對照組；b.10 μg/L OPG；c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPGFig.1 OC morphology(×100)a.control group; b.10 μg/L OPG; c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPG

2.2 OC染色結(jié)果 培養(yǎng)結(jié)束后，將玻片取出，嚴(yán)格按照試劑盒所述步驟進(jìn)行TRAP染色，各組均可見TRAP染色陽性細(xì)胞，主要為多核細(xì)胞且體積較大，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有紅色的陽性顆粒及棕紅色沉淀。對陽性多核細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)分析，結(jié)果顯示，OC細(xì)胞數(shù)隨著OPG濃度的增大而逐漸減少。且同對照組相比，當(dāng)OPG的濃度為10 μg/L時，2組OC細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異，當(dāng)OPG的濃度為20、50 μg/L時，OPG組的OC數(shù)顯著減少(P<0.05)，而當(dāng)OPG的濃度為100 μg/L時，OPG組的OC數(shù)呈極顯著減少(P<0.01)。見圖2、圖3。

圖2 TRAP染色陽性 OC(×100)Fig.2 Osteoclasts stained with TRAP(×100)

圖3 OPG濃度對小鼠OC數(shù)量的影響結(jié)果(×400)*P<0.05，**P<0.05，與對照組比較Fig.3 Effect of OPG concentration on the number of OC in mice results(×400)*P<0.05，**P<0.05，compared with control group

嚴(yán)格按照說明書用Phalloidin-TRITC進(jìn)行染色，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞(OC)內(nèi)細(xì)胞骨架F-actin均勻彌散分布著絲狀物；而對照組細(xì)胞骨架F-actin多為形狀規(guī)則，邊界清晰且數(shù)目較多。F-actin環(huán)數(shù)目隨著骨保護(hù)素(OPG)濃度的增加而呈現(xiàn)出劑量依賴性減少，環(huán)的輪廓模糊不清，甚至出現(xiàn)裂環(huán)現(xiàn)象，見圖4。

圖4 OPG對小鼠OC內(nèi)F-actin環(huán)的影響(×400)a.對照組；b.10 μg/L OPG；c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPGFig.4 Effects of OPG on the mouse OC F-actin ring (×400)a.control group；b.10 μg/L OPG；c.20 μg/L OPG；d.50 μg/L OPG；e.100 μg/L OPG

2.3 骨吸收陷窩面積的計算 牛皮質(zhì)骨片經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，對照組存在明顯的骨吸收陷窩，陷窩長度約為5～80 μm，較深。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析表明，OPG實(shí)驗(yàn)組的骨吸收陷窩的面積、密度和減弱程度均與其OPG的濃度呈正相關(guān)(r=0.459；r=0.426；r=0.389，均P<0.05)，且OPG各濃度組骨吸收陷窩面積與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 OPG對小鼠OC骨吸收功能的影響*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較Fig.5 Effect of OPG on mouse OC resorption*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

3 討論

骨保護(hù)素(OPG)是一種可溶性分泌型糖蛋白，可以作為假受體與RANK競爭性的結(jié)合RANKL，從而阻斷OC的分化、成熟并誘導(dǎo)其凋來抑制OC的骨吸收功能。研究表明，敲除了OPG基因的小鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松等現(xiàn)象，但是轉(zhuǎn)OPG基因鼠的骨密度卻呈現(xiàn)升高的趨勢，故OPG類代表藥已于2012年被批準(zhǔn)使用[5]。近些年發(fā)現(xiàn)，OPG不僅影響著骨骼的吸收，同時與免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等方面息息相關(guān)，如徐高陽[6]研究的OPG與動脈粥樣硬化之間的關(guān)系，在OPG的研究領(lǐng)域中，這為今后的研究提供了一個全新的研究角度。

OC 是一種終末分化的多核巨細(xì)胞且與單核細(xì)胞來源相同，其生成受到核因子和巨噬細(xì)胞集落刺激因子的調(diào)控。就目前的研究狀況而言，國內(nèi)外均無成熟的具有OC特征的細(xì)胞株，所以對于OC的獲得也僅依靠從組織中分離而獲得這一主要途徑。在本次研究中采用無菌分離前肢肱骨及兩后肢長骨而取得骨髓細(xì)胞的技術(shù)，這樣得到的細(xì)胞能保持其最高活性，其表現(xiàn)最接近人體生理指標(biāo)。在破骨細(xì)胞的鑒定檢測中，形態(tài)觀察、TRAP染色、組織蛋白酶K的基因水平檢測及骨磨片上骨吸收陷窩的形成能力為當(dāng)前使用最為廣泛的檢測方式[7]。針對本研究選取形態(tài)觀察、TRAP染色及骨片吸收陷窩形成這3種手段對離體的OC進(jìn)行鑒定分析。

近些年，在OC的鑒別中，通常采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)作為OC的特異性酶對其進(jìn)行組織鑒別[7]。本次實(shí)驗(yàn)也選用這種方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此鑒別方法簡便、可靠。在細(xì)胞骨架中，微絲在細(xì)胞的形態(tài)維持、發(fā)生運(yùn)動和分裂分化中起重要作用[8]。在微絲的組織結(jié)構(gòu)分析中，Actin為其基礎(chǔ)蛋白，能夠較好地反映微絲的結(jié)構(gòu)形態(tài)，且F-actin為細(xì)胞骨架的重要部分[9]。在本次實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞骨架F-actin多為形狀規(guī)則，邊界清晰且數(shù)目較多，與張紅菊[10]的報道結(jié)果一致，說明本次實(shí)驗(yàn)所選的染色檢測手段適用于對OC的研究。

在OC的體外培養(yǎng)中，數(shù)量少、純度低、不能傳代一直是制約其廣泛研究的重要問題[11-14]。在實(shí)驗(yàn)研究中，原代分離的OC具有更好的生物學(xué)特性，能更好地保持其生理活性，更準(zhǔn)確地反映機(jī)體的生理變化。在本次實(shí)驗(yàn)中，盡量保持其細(xì)胞的純度，通過TRAP染色、F-actin染色及骨吸收陷窩的鑒定等技術(shù)手段，確定本次分離得到了典型的小鼠OC。

綜上所述，不同濃度的骨保護(hù)素(OPG)對破骨細(xì)胞(OC)的活性的影響程度不同，當(dāng)OPG的濃度為20、50 μg/L時，OPG組的OC數(shù)顯著減少(P<0.05)，而當(dāng)OPG的濃度為100 μg/L時，OPG組的OC數(shù)呈極顯著減少(P<0.01)。所以，不同濃度的OPG對破骨細(xì)胞的影響程度不同，且OPG的濃度越大，其抑制性越強(qiáng)。

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(編校：譚玲，王儼儼)

Effect of osteoprotegerin on osteoclasts

LIU Jian1,SONG Hui2

(1.Department of Orthopedics, Shandong Hospital of Shengli Oil Field of Dongying City, Dongying 257000, China; 2.Shandong University, Ji’nan 250000，China)

ObjectiveTo analyse the effects of OPG (osteoprotegerin, OPG) at different concentrations on activity of osteoclasts (osteoclasts, OC), and the relationship between them in physiological activity and function.MethodsThe bone marrow cells of six weeks old female mice were collected and cultured in vitro on the basis of adding different levels of OPG(10, 20, 50, 100 μg/L).The relationship between OPG and OC were analysed by tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining, F-actin cytoskeleton staining and bone resorption pits.ResultsOC showed adherent growth within 1h cultured, and there were no large multicore OC.Cultured for 5 days, the smaller monocytes gradually began to fusion with each other to form multinucleated cells and showed distinctive characteristics.After three days OPG treatment, the number of multicore cells gradually reduced with OPG concentration increaseing in experimental group, and showing a negative correlation between them(r=-0.516，P<0.05).And there were only a small amount of multinucleated cells at OPG concentration of 50 μg/L.At 20,50 μg/L of OPG concentration, OC number significantly decreased compared with control group (P<0.05), and when the concentration of OPG was 100 μg/L, OC number showed significant reduction (P<0 01).the experimental group OPG bone resorption lacunae area, density and decrease the degree were positively correlated with concentration of OPG (r=0.459；r=0.426；r=0.389，P<0.05), and the area had a significant difference when two groups compared.ConclusionThe inhibitive effects of OPG on OC function and activation increase with concentration increasing.

osteoprotegerin; osteoclasts ;resorption pits

2008年山東省自然科學(xué)基金(Y2008C99)

劉建，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：骨科關(guān)節(jié)及相關(guān)性疾病，E-mail：LJ13905469304@163.com。

R3

A

1005-1678(2015)03-0065-04