人參多糖對秀麗線蟲polyQ聚集毒性和壽命的影響

陳佩雷,潘建春

(1.溫州醫科大學附屬樂清醫院 臨床藥學室，浙江 樂清 325600；2.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035)

?

人參多糖對秀麗線蟲polyQ聚集毒性和壽命的影響

陳佩雷1,潘建春2Δ

(1.溫州醫科大學附屬樂清醫院 臨床藥學室，浙江 樂清 325600；2.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035)

目的 探討人參多糖對秀麗線蟲polyQ聚集毒性和壽命的影響。方法 將秀麗線蟲HA759和AM141各分成2組，Control組和Ginseng組。Control組，不做任何特殊處理，Ginseng組將10 mg/mL中藥多糖與 OP50-1按照 1:4 的比例混合至總體積 50 mL后加入秀麗線蟲培養平皿。觀察秀麗線蟲HA759 ASH 神經元的存活狀況；每天取樣統計秀麗線蟲AM141周身聚集熒光點數；研究2種秀麗線蟲的壽命。結果 研究表明，培養3 d后Control組 HA759秀麗線蟲ASH 神經元存活率為53%，Ginseng組ASH 神經元存活率為64%，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。Control組AM141秀麗線蟲在生長發育中，其體壁細胞中的聚集點逐漸增多，48、72、96 h的熒光聚集點數分別為(6±1)、(27±2)、(56±4)個。Ginseng組秀麗線蟲熒光點數在48 h為(4±1)個，72 h和96 h分別為(20±3)、(45±2)個，相比對照均有所下降(均P<0.05)。2種秀麗線蟲存活時間從第5天開始即出現差異(P<0.05)，Control組AM141秀麗線蟲平均存活時間為(23±2)d，Ginseng組為(27±2)d；Control組HA759秀麗線蟲平均存活時間為(24±2)d，Ginseng組為(27±2)d。結論 人參多糖能延長秀麗線蟲壽命，而抑制 polyQ聚集并緩解與衰老相關的 polyQ 神經毒性。

人參多糖；秀麗線蟲；神經毒性；壽命

在世界人口老齡化的21世紀，患與衰老相關的神經退行性疾病的人越來越多，由此給患者家庭和社會帶來沉重負擔[1]。預計2050年，世界范圍內患有此類疾病的患者將達到1 億，而目前人類還不能科學系統的闡明此類疾病的發病機理，也沒有有效的治療途徑，因此加強對衰老相關的神經退行性疾病的研究成為醫療機構和制藥行業高度重視的重大科學任務[2]。衰老促發了一系列衰老相關的疾病，蛋白聚集毒性是衰老相關神經退行性疾病的主要病理特征[3]。人參多糖在抗衰老及衰老相關疾病方面具有獨特優勢，但其能否緩解神經退行性疾病中的蛋白毒性？本文旨在通過秀麗線蟲模型來探討人參多糖對秀麗線蟲polyQ聚集毒性和壽命的影響。

1 材料與方法

1.1 藥材與菌株 人參(PanaxginsengC.A.mey)購自亳州康圣藥業有限公司，產地東北，批號20120201。

AM141、HA759秀麗線蟲株以及OP50-1來源于中南大學秀麗線蟲遺傳中心。

1.2 試劑 瓊脂57-50-1 CP(日本廣野株式會社)；瓊脂糖(OXOID)；Trizol Agent(Invitrogen)；SYBR Green1 QPK-201(TOYOBO)；SYBR Green Master (Rox) 049138500， (Roche)；Quanti Test SYBR Green PCR kit(Qiagen)；100bp DNA ladder MD109(Tiangen)；DEAE-Sepharose FAST Flow 500Ml(Amersham Biosciences)；Goldview 電泳染色劑MN407 (博大泰克)；其余試劑均為國產分析純。

1.3 實驗儀器 BSC 系列生物安全柜 BES-13611A2(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；AIR TECH 潔凈工作臺SW-CJ-1FD(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術制造公司)；PCR 儀(Tpersonal Biometra)；定量 PCR BIORAD(聯想生物技術有限公司)；高速離心機1-14(Sigma)；AllegraX-30R centrifuge ALZ11L080(BECKMAN COULTER)；酶標儀 RS-232C MK3(Thermo Labsystems)；熒光酶標儀(Thermo)；電泳儀DYY-6C，紫外儀 WD-9403D，電泳槽 DYCP-33A(北京市六一儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 秀麗線蟲的培養、轉接和同步化：采用固體NGM培養基培養線蟲。

傳代線蟲采用瓊脂快轉接法；轉接大量線蟲采用M9洗滌法；單個秀麗線蟲的轉接用鉑金絲挑取線蟲到新的 NGM板里。秀麗線蟲的同步化培養：L4期線蟲擁有明顯的生理學特征，在實驗中可以客觀地辨別，因此可采用挑取線蟲法來得到同步化蟲子。將產卵高峰的秀麗線蟲置于新的含有食物菌苔的平皿中，讓其產卵 3～4 h，再將成蟲移走，將帶有蟲卵的平皿置于20 ℃培養，待平皿中卵孵化后，便可得到同步化效果的線蟲。

1.4.2 秀麗線蟲的多聚谷氨酰胺聚集毒性實驗：瓊脂糖墊制備：稱取1 g瓊脂糖，加入50 mL S·Medium，解凍狀態下微波加熱5 min，使其完全融化呈透明液體，然后將一塊載玻片(厚度約為 1 mm)放在兩塊玻璃板(厚度約為 2 mm)之間，趁熱吸取0.5 mL瓊脂糖滴在載玻片的中央，隨即從一側輕輕蓋上另一塊載玻片，待瓊脂糖冷去凝固后，小心移走上層載玻片，下層載玻片中央即成厚度約為 1 mm的圓形瓊脂糖墊，可用于固定秀麗線蟲。

HA759秀麗線蟲的準備：按照上述方法獲得所需要的秀麗線蟲，將L1期同步化的HA759線蟲加入到給藥平皿里，15 ℃生化培養箱培養3 d。

神經元存活統計：用 M9 溶液洗固體平皿，收集秀麗線蟲于 1.5 mL離心管中，室溫3500 r/min離心1 min，棄上層溶液，重復此步驟 2次，最后用M9定容至50 μL，加入10 μL 20 mM NaN3溶液麻痹秀麗線蟲，混勻后取出 20 μL 滴加在制備好的瓊脂糖墊上，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察，ASH 和ASI神經元位于秀麗線蟲咽部后兩側的神經元附件，經過3 d孵育，理論上ASH神經元僅存活10%[4]。而 ASI 神經元基本不衰亡，可以通過觀察黃綠色熒光點來判斷 ASH神經元狀態。ASH神經元存活率(neuronal survival)計算公式如下：Neuronal survival(%)=[ Nsurvival/(Nsurvival+Ndead)]×100。公式中，Nsurvival和Ndead分別代表 ASH 神經元存活和死亡的秀麗線蟲數目。

1.4.3 人參多糖對秀麗線蟲模型中多聚谷氨酰胺的抑制作用：AM141 秀麗線蟲模型(rm)是在其 unc-54基因上轉入了融合YFP的40個多聚谷氨酰胺長度的polyQ重復片段(polyQ)構建而成。由于 unc-54是不協調基因，其本身表達在秀麗線蟲肌球蛋白重鏈上，如果 polyQ 在其中表達則會導致polyQ 在體壁肌肉層聚集，導致因肌肉運動障礙而出現運動能力減退現象。由于是與 YFP融合，因而可以在熒光顯微鏡下觀察到表現為黃綠色的熒光點。

將同步化的 L1 期線蟲加入到給藥的平皿中(10 mg/mL人參多糖)，生化培養箱 20 ℃培養4 d。第2天開始，每天收集1個給藥平皿中的秀麗線蟲；在熒光顯微鏡下統計秀麗線蟲周身的熒光點數，如此連續統計3 d。

1.4.4 秀麗線蟲的固體壽命實驗 ：取10 mg/mL 的人參多糖，在旋轉器上旋轉促溶3 h，使其充分溶解后，過0.45 μm微孔濾膜除菌及不溶雜質。用S·Medium稀釋成不同的人參多糖溶液：每次實驗現用現配。實驗分2組，Control組和Ginseng組。Control組，不做任何特殊處理，Ginseng組將藥物(10 mg/mL人參多糖)與 OP50-1按照1:4的比例混合體積至 50 mL，將混合液加入平皿，輕輕晃動，使均勻分布于平皿中央。操作臺中放置，使菌液充分被吸收，至不再流動。

準備實驗所需L4期秀麗線蟲：用鉑金絲將10條產卵期的秀麗線蟲轉移到35 mm的玻璃平皿上，產卵3 h后，將蟲子移走，將有蟲卵的平皿20 ℃培養48 h 達到L4期，根據實驗樣本量，確定產卵期蟲子個數。產卵期蟲子平均每個蟲子產卵6個/h。

上樣：將L4期的蟲子挑到鋪好的平皿上，35～40條/板，每個組別分別做 3個平行平皿，使每組的樣本量約為100條。20 ℃培養箱中培養。

培養和數據統計：產卵期的秀麗線蟲，每天都要用鉑金絲將線蟲轉移到新的平皿上；之后每隔1天轉移1次。詳細記錄線蟲的死亡個數及死亡狀況(機械損傷、爬墻、內孵)。用鉑金絲觸之尾部，頭部均不動者判斷為死亡，每天統計，直至秀麗線蟲全部死亡。

2 結果

2.1 人參多糖對多聚谷氨酰胺聚集毒性的影響 將同步化的L1期 HA759秀麗線蟲加入到對照和給藥平皿中，15 ℃培養3 d，熒光顯微鏡下統計熒光點。未經多糖處理的Control組 HA759秀麗線蟲在培養3d后，ASH 神經元存活率為53%。Ginseng組HA759秀麗線蟲ASH 神經元存活率有所提高，達到了64%，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。表明人參多糖具有緩解 polyQ 聚集介導的神經毒性作用。

圖1 人參多糖對HA759秀麗線蟲 ASH 神經元存活的影響*P<0.05，與control組相比Fig.1 Effect of ginseng on ASH neuron survival in HA759 model*P<0.05，compared with control group

2.2 人參多糖對多聚谷氨酰胺聚集的抑制作用 未經多糖處理的AM141秀麗線蟲，在生長發育中其體壁細胞中的聚集點逐漸增多，48～96 h的熒光聚集點數分別為(6±1)、(27±2)、(56±4)個。加入100 μg/plate的人參多糖處理后，熒光點數在48 h為(4±1)個，在72 h和96 h分別為(20±3)、(45±2)個，相比對照均有所下降(P<0.05)，見圖2、圖3。結果表明，人參多糖對 AM141PolyQ 的聚集有一定的緩解作用。

圖2 AM141秀麗線蟲體壁細胞熒光點的表達情況Fig.2 AM141 C.elegans somatic cell fluorescence expression

圖3 人參多糖對AM141秀麗線蟲體壁熒光聚集點的影響*P<0.05，與control組相比Fig.3 Effect of ginseng polysaccharide on AM141 C.elegans somatic fluorescence point*P<0.05, compared with control group

2.3 人參多糖對Poly Q模型秀麗線蟲壽命的影響 對AM141、HA759秀麗線蟲以100 μg/plate劑量的人參多糖處理，觀察其對秀麗線蟲壽命的影響。從第5天開始，Control組和Ginseng組就出現明顯差別；Control組AM141秀麗線蟲平均存活時間為(23±2)d，Ginseng組AM141秀麗線蟲平均存活時間為(27±2)d；Control組HA759秀麗線蟲平均存活時間為(24±2)d，Ginseng組HA759秀麗線蟲平均存活時間為(27±2)d，2組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 人參多糖對 AM141(A)和HA759(B)秀麗線蟲壽命的影響Fig.4 Effect of ginseng polysaccharide on the lifespan of C.elegans AM141 (A) and HA759 (B)

3 討論

衰老的特點是細胞內大分子，包括被自由基損傷蛋白質的不斷積累[5]。隨著機體衰老，細胞內氧化自由基的含量呈指數增加，蛋白質的這種不可逆氧化損傷也隨著衰老惡化，相應的由此引發的神經毒性也隨之加劇[6-8]。衰老是神經退行性疾病的高危因子，那么具有延緩衰老的藥物是否可以緩解神經退行性疾病蛋白的毒性?文獻報道，在秀麗線蟲polyQ 蛋白聚集產生的毒性是有壽命依賴性的，同時，聚集引起的毒性又進一步加速衰老，此時，蛋白動態平衡總體表現出失調和紊亂的發展趨勢[9-11]。胰島素樣信號是線蟲壽命的主要調控者，對此通路進行遺傳學操作以延長線蟲壽命，polyQ聚集也會隨之延遲[12]。研究表明，淀粉樣蛋白結合染料硫磺素T能夠延長秀麗線蟲的壽命，穩定突變的亞穩態蛋白質和緩解Aβ 聚集毒性，還可以通過調控分子伴侶和蛋白質降解途徑以減緩polyQ聚集[13]。

本研究發現，人參多糖緩解了polyQ 模型HA759線蟲株中由polyQ異常聚集介導的神經毒性，減少了AM141 體壁細胞中PolyQ蛋白的聚集，說明人參多糖是通過減緩多聚谷氨酰胺的聚集起到神經保護作用的。最近研究表明，蛋白動態失衡不僅是經退行性疾病發生和發展的重要因素，也是衰老的主要特征，壽命調節相關信號是聯系衰老、蛋白動態平衡以及神經退行性疾病這3者的重要橋梁[14-15]。而本文中人參多糖分別不同程度的延長 polyQ 秀麗線蟲模型AM141及HA759的壽命，也證實了其增強機體維護蛋白平衡的能力。

本文以天然人參多糖為研究對象，利用模式生物秀麗線蟲及現代生物學技術和方法，針對與衰老及衰老相關的神經退行性疾病進行生物活性和作用機理的研究。研究結果表明，人參多糖不僅能夠延長秀麗線蟲的壽命，而且還能抑制 polyQ 聚集并緩解與衰老相關的 polyQ 神經毒性，說明人參多糖可以通過延緩衰老，維護蛋白質平衡，起到神經保護作用。這些研究結果為抗衰老中藥在治療衰老相關的神經退行性疾病提供了理論參考。

[1] Alavez S,Vantipalli MC,Zucker DJ,et al.Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan[J].Nature,2011,472(7342):226-229.

[2] Attele AS,WuJA,Yuan CS.Ginseng Pharmacology:multiple constituents and multiple actions[J].Biochem Pharmacol,1999,58(11): 1685-1693.

[3] Bauer PO,Wong HK,Oyama F,et al.Inhibition of rho kinases enhances the degradation of mutant huntingtin[J].Biol Chem,2009,284(19),13153-13164.

[4] Guo M,Wu TH,Song YX,et al.Reciprocal inhibition between sensory ASH and ASI neurons modulates nociception and avoidance in Caenorhabditis elegans.[J].Nat Commun,2015 (6):5655.

[5] Bence NF,Sampat RM,Kopito RR.Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation[J].Science,2001,292(5521):1552-1555.

[6] Bennett EJ,Shaler TA,Woodman B,et al.Global changes to the ubiquitin system in Huntington’s disease[J].Nature,2007,448(7154):704-708.

[7] Bercovich B,Stancovski I,Mayer A,et al.Ubiquitin-dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70[J].J Biol Chem,1997,272(14):9002-9010.

[8] Bergmann A.Autophagy and cell death:no longer at odds[J].Cell,2007,131(6):1032-1034.

[9] BI.Oxidative damage linked to neurodegenerationby -synuclein nitration in synucleinopathy lesions[J].Science,2000,290(11):985-989 .

[10] Ravikumar B,Vacher C,Berger Z,et al.Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease[J].Nat Genet,36(6):585-595.

[11] Zabel C,Nguyen HP, Hin SC,et al.Proteasome and oxidative phoshorylation changes may explain why aging is a risk factor for neurodegenerative disorders[J].J Proteomics,2010,73(11):2230-2238.

[12] Butterfield DA,Lauderback CM.Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer’s disease brain:potential causes and consequences involving amyloid β-peptide-associated free radical oxidative stress[J].Free Radic Biol Med,2002,32(11):1050-1060.

[13] Rubinsztein DC,Gestwicki JE,Murphy LO,et al.Potential therapeutic applications of autophagy[J].Nat Rev Drug Discov,2007,6(4):304-312.

[14] Douglas PM,Dillin A.Protein homeostasis and aging in neurodegeneration[J].J Cell Biol,2010,190(5):719-729.

[15] Douglas PM,Summers DW,Cyr DM.Molecular chaperones antagonize proteotoxicity by differentially modulating protein aggregation pathways[J].Prion,2009,3(3):51-58.

(編校：吳茜)

Effect of ginseng polysaccharides on polyQ accumulation toxicity and lifes pan ofCaenorhabditiselegans

CHEN Pei-lei1,PAN Jian-chun2Δ

(1.Department of Clinical Pharmacy, Yueqing Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Yueqing 325600, China; 2.College of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

ObjectiveTo study the ginseng polysaccharides for prolonging the life span of theC.elegansand inhibit the toxic effects of polyQ accumulation.MethodsCaenorhabditis elegans of HA759 and AM141 were divided into control group and Ginseng group, seprately.Control group didn’t do any special treatment, Ginseng group were given 10 mg/mL polysaccharide and OP50-1 in the proportion of 1:4 mixed volume to 50 mL.C.elegansof glutamine (polyQ) polymer HA759 neurotoxicity model test of glutamine protein polymer toxicity experiment were done.The ASH neuron survival condition were tested.After sampling statistics gathered nematodes in the whole fluorescent points every day, study ginseng polysaccharide on polymers glutamine aggregation inhibition.Finally the solid life of twoC.elegans were studied.ResultsThe survival rate of ASH neurons inCaenorhabditiselegansHA759 of control group after 3 days culture was 53%.which of Ginseng group was 64% (P<0.05).The fluorescence of 48～96h aggregation points inCaenorhabditiselegansAM141 of control group were(6±1), (27±2), (56±4), which of Ginseng group were (4±1) in 48 h, (20±3) in 72 h and (45±2) in 96 h, the differences between two groups were all significant(P<0.05).The average survival time ofCaenorhabditiselegansAM141 of control group was (23±2)days, which of Ginseng group was (27±2)days; average survival time ofCaenorhabditiselegansHA759 of control group was (24±2)days, which of Ginseng group was (27±2)days,the difterences were all signiyicant(P<0.05).ConclusionGinseng polysaccharides can not only prolong the lifespan of theC.elegans, but also can restrain polyQ gathered and ease the polyQ neurotoxicity associated with aging.

ginseng polysaccharide;C.elegans;neurotoxicity;life span

陳佩雷，女，碩士在讀，主管藥師，研究方向：臨床藥學與藥物分析，E-mail：C13868847229@163.com；潘建春，通訊作者，男，本科，教授，研究方向：神經藥理學，E-mail：pjc13857750765@163.com。

R9

A

1005-1678(2015)03-0069-03