SULT1A3與芹菜素的磺酸化結合反應的動力學特征研究

蔣昆諭,呂曉,周昱,周一平,馬穎林,孟勝男

(中國醫科大學藥學院 藥劑教研室，遼寧 沈陽 110013)

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SULT1A3與芹菜素的磺酸化結合反應的動力學特征研究

(中國醫科大學藥學院 藥劑教研室，遼寧 沈陽 110013)

目的 研究人重組酶SULT1A3與芹菜素的磺酸化結合反應的動力學特征。方法 采用高效液相色譜法，測定芹菜素的消除量及其磺酸化結合反應代謝產物的生成量，并應用LC-MS/MS液質聯用技術鑒定其結構。建立芹菜素與重組酶SULT1A3體外反應體系，測定SULT1A3催化不同濃度芹菜素的磺酸化結合反應代謝速率，采用GraphPad Prism 5軟件對其進行酶動力學分析。結果 芹菜素在0.15625～30 μM范圍內線性關系良好，平均回收率大于80%，日內和日間的RSD均小于15%。芹菜素與SULT1A3孵育體系中的代謝產物為單磺酸化結合產物。芹菜素與人重組酶SULT1A3的反應呈底物抑制動力學特征。芹菜素與SULT1A3酶反應的動力學參數Km和Ksi分別為(0.355±1.04)、(23.62±0.06) μM，Vmax為(65.71±1.30) nmol/(min·mg)，Vmax/Km為185.10 mL/(min·mg)。結論 人重組酶SULT1A3可介導芹菜素的磺酸化結合反應，且其酶動力學特征呈現底物抑制效應。推測由SULT1A3介導的磺酸化結合反應可能在芹菜素的體內II相代謝中發揮重要的作用。

芹菜素；SULT1A3重組酶；磺酸化代謝；動力學特征

圖1 芹菜素結構圖Fig.1 Structure of apigenin

芹菜素(apigenin, API)是一類廣泛存在于蔬菜和水果中的黃酮類化合物，化學名為4’,5,7 -三羥基黃酮，見圖1[1]。對多種腫瘤具有抑制生長，誘導凋亡的作用，此外還具有預防高血壓、抗炎、抗氧化等藥理作用[2-4]。但是由于芹菜素的理化性質，水溶性較差，生物利用度較低，在一定程度上限制了它的應用。研究發現芹菜素在人體內存在強烈的Ⅱ相代謝反應，這是導致其生物利用度低的主要原因[5-6]。由磺基轉移酶(sulfotransferases, SULTs)介導的磺酸化結合反應是一種重要的Ⅱ相代謝反應。SULT1A3是SULTs超基因家族中的一個重要的亞酶，在人體內尤其是小腸內表達量多，底物譜廣泛且多為兒茶酚胺類化合物[7-8]。目前，SULT1A3是否在芹菜素的磺酸化代謝中發揮作用以及其代謝特性尚不清楚。本文應用人重組SULT1A3與芹菜素的體外孵育體系，考察芹菜素的磺酸化代謝特性，為進一步闡明芹菜素的體內代謝行為，促進其在臨床合理、有效應用提供理論基礎和科學指導。

1 材料與方法

1.1 儀器 HPLC- waters 2695，2489 UV檢測器；API 3200 Q Trap三重四極桿質譜(Applied Biosystem/MDS SCIEX， Foster City， CA)；SHA-CA恒溫水浴震蕩器(金壇市精達儀器制造廠)；紫外分光光度計TU-1901(北京普析通用儀器有限責任公司)；TLL-C高速冷凍離心機(北京四環科學儀器廠)；METTLER TOLEDO AL104分析天平、METTLER TOLEDO 320 pH計(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 藥品與試劑 芹菜素(陜西慧科，純度>99%)；人重組酶SULT1A3(英國Cypex)；3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(3′-Phosphoadenosine 5′-phosphosulfate， PAPS)(美國sigma)；色譜純乙腈(天津康科德)；醋酸銨、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀(分析純)；超純水(Millipore)。

1.3 色譜與質譜條件 色譜分析條件為：色譜柱：Thermo-C18(250 mm×4.6 mm，5 μM)；流動相：乙腈(A)-(2.5 mM)pH4.5醋酸銨水溶液(B)，梯度洗脫，0～2 min，10%～25%A ；2～3 min，25%～40%A ；3～5 min，40%～60%A ；5～9 min，60%～65%A；9～15 min，65%～80%A；15～16 min，80%～90%A；16～18 min，90%～10%A；18～20 min，10%A。內標：睪酮。進樣量：20 μL。流速：1 mL/ min。本實驗采用雙通道紫外檢測波長：254 nm(內標)和340 nm(芹菜素及其代謝產物)。柱溫：30 ℃。采用液相色譜質譜方法測定芹菜素及其磺酸化代謝產物。質譜分析條件：負離子方式檢測；離子噴霧電壓：-4.0 kV；源溫度：400 ℃；噴霧氣(gas l)：氮氣，40 psi；渦輪氣(gas 2)：氫氣，20 psi；保護氣：氮氣，20 psi。采用一級全掃描質譜及選擇離子全掃描二級質譜2種方式同時測定。

1.4 體外代謝系統孵育條件及樣品處理 芹菜素的磺酸化代謝反應 芹菜素與SULT1A3的酶動力學實驗：取系列濃度的芹菜素適量，分別加入50 mM KPI緩沖液中(pH7.4)，加入SULT1A3酶(終濃度為0.00267～0.0053 mg/mL)，最后加入0.1 mM PAPS溶液啟始反應，孵育體系總體積為200 μL，混勻，37 ℃水浴孵育一定時間后，加入預凍的50 μL的100 μM睪丸酮溶液終止反應[9-10]。

樣品處理：反應終止后，樣品進行渦旋60 s后進行離心(4 ℃， 7700×g)，離心20 min，取上清液進行HPLC及HPLC/MS/MS分析測定，進樣量20 μL。

底物抑制動力學方程：

V為酶反應速率，C為底物濃度，Vmax為高親和狀態時的最大反應速率，Km是達到Vmax一半時底物的濃度，Ksi是底物抑制常數[11]。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.2.1 線性與專屬性：在本實驗的檢測條件下，本方法具有良好的專屬性，芹菜素及其代謝產物峰形良好，無內源性雜質干擾。芹菜素標準曲線方程為y=0.042x-0.011，相關系數R2=0.999，其中y代表芹菜素與內標睪酮峰面積的比值，x代表芹菜素的濃度。芹菜素代謝產物濃度在0.15625～30 μM范圍內具有良好的線性關系。

2.2.2 回收率與精密度：芹菜素在人重組SULT1A3酶中濃度分別為2.5、10、30 μmol/L 時，提取回收率(n=6) 分別為(89.23±5.50)%、(88.27±3.45)%、(86.30±4.86)%。日內精密度 RSD(n=6)分別為 2.01%、0.43%、0.46%; 日間精密度 RSD(n=6)分別為3.57 %、2.28%、2.35%。

2.2 芹菜素磺酸化結合產物HPLC圖譜的確認與定量 芹菜素與SULT1A3孵育體系反應后，產生一種磺酸化代謝產物(API-S)，其出峰時間為7.1 min，該峰位于母體(API)的前面，芹菜素的保留時間為8.5 min，見圖2。該代謝產物在不加PAPS的體系中則不產生。由于無市售芹菜素磺酸化代謝產物，因此本研究基于其母體芹菜素的標準曲線，以及確定兩者之間的轉換因子K并進行校正，從而對芹菜素代謝產物進行定量。本實驗測得的芹菜素磺酸化代謝產物與芹菜素之間的轉化因子K值為1.18。具體操作參見文獻[12]。

芹菜素在SULT1A3空白孵育體系(不加PAPS) 芹菜素在SULT1A3孵育體系圖2 芹菜素在SULT1A3孵育體系的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC profile of API and API-S in SULT1A3

2.3 LC/MS/MS鑒定芹菜素的磺酸化代謝產物 本實驗采用LC/MS/MS技術進一步鑒定芹菜素及其代謝產物的結構。質譜檢測結果顯示，樣品產生的準分子離子峰[M-H]-m/z為349.2，與芹菜素的磺酸化結合產物的相對分子質量(350.2)相吻合。另一分子離子峰m/z為268.6 與準分子離子峰的相對分子質量相差80，推斷其為[M-SO3]-，即丟失1個磺酸基碎片所致。由此可確認代謝產物即為芹菜素磺酸化結合反應產物。見圖3。

圖3 芹菜素及其代謝產物的質譜圖Fig.3 LC-MS/MS profile of apigenin and its metabolites

2.4 芹菜素在人重組SULT1A3中代謝的酶動力學考察 芹菜素與SULT1A3的酶促動力學曲線見圖4，其對應的Eadie-Hofstee見圖5。芹菜素與SULT1A3的反應呈現底物抑制的動力學特點，即SULT1A3介導的芹菜素磺酸化代謝反應速率隨芹菜素濃度增大而升高，而當芹菜素濃度大于4 μM時則逐漸降低。SULT1A3介導芹菜素的動力學參數Km和Ksi分別為(0.355±1.04)，(23.62±0.06) μM，Vmax為(65.71±1.30)nmol/(min·mg)，Vmax/Km為185.10 mL/(min·mg)。

圖4 芹菜素與SULT1A3的酶促反應動力學曲線圖Fig.4 Kinetic curve of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin

圖5 芹菜素與SULT1A3的酶促反應的Eadie-Hofstee圖Fig.5 Eadie-Hofstee plot of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin

3 討論

磺酸化結合反應是內源性物質和外源性物質的重要代謝途徑。在磺酸化結合反應中，SULT1A3將其輔因子3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)的親電子硫基部分轉移至芹菜素的酚羥基上，生成親電子的硫酸酯類復合物[13-14]，使底物的親水性增加，使其利于排泄。由于芹菜素具有3個酚羥基，本研究證明芹菜素磺酸化結合反應只產生一種代謝產物，即可推測PAPS只與芹菜素的1個酚羥基相結合，PAPS的親電子硫基部分具體轉移至哪個酚羥基上則需進一步研究。

本研究中SULT1A3介導的芹菜素磺酸化結合反應呈現底物抑制動力學特點，提示在高底物濃度下代謝速率減小。SULT1A3介導的芹菜素磺酸化代謝反應的Km較小，且Vmax/Km較大，說明芹菜素在與SULT1A3反應具有高親和性和高體內清除率。而Riches等[15]證明的SULT1A3在人腸道內表達量較多，肝臟中幾乎不表達，由此可推斷由SULT1A3介導的磺酸化結合反應可能在芹菜素的體內II相代謝中發揮重要的作用，小腸可能是芹菜素磺酸化代謝的主要器官之一。后續研究將對芹菜素的II相代謝特征進行綜合考察。

本研究首次明確了SULTs家族中由SULT1A3介導的芹菜素磺酸化代謝的酶動力學特性。了解芹菜素的代謝特點有助于解析芹菜素發揮藥效和毒性反應的物質基礎，并能提高其生物利用度的辦法，將為芹菜素的藥用開發及其在臨床合理應用提供理論支持和科學指導。

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(編校：王冬梅)

Study on kinectics characteristics of the sulfation of apigenin by SULTIA3

JIANG Kun-yu,LV Xiao-yue,ZHOU Yu,ZHOU Yi-ping,MA Ying-lin,MENG Sheng-nanΔ

(Department of Pharmaceutics, School of pharmacy, China Medical University, Shenyang 110013, China)

ObjectiveTo investigate the kinectics characteristics of sulfation of apigenin mediated by SULTIA3.MethodsAfter incubation of apigenin using in vitro SULT1A3 system, high-performance liquid chromatography was utilized to determine the sulfates of apigenin. Mass spectrum(MS) were employed to elucidate the structure of metabolite. The program GraphPad Prism 5 was used to perform the kinetic characterization of SULT1A3 catalyzed metabolism of apigenin.ResultsA liner calibration curve for the assay of apigenin was validated in the range of 0.15625～30 μM with the recoveries of at least 80% and intra-day and inter-day RSD of less than 15%. Metabolic product of apigenin and SULT1A3 in the incubated system was identified one monosulfate. The metabolic behavior of apigenin in SULT1A3 was followed substrate inhibition kinetics. Apparent kinetic parameters of metabolism of apigenin by SULT1A3, Kmwas(0.355±1.04) μM and Ksiwas(23.62±0.06) μM，Vmaxwas(65.71±1.30) nmol/(min·mg)，Vmax/Kmwas 185.10 mL/(min·mg).ConclusionSULT1A3 can mediate the binding of apigenin sulfonated reaction, and the character of enzymatic kinetics shows substrate inhibition. Sulfation of apigenin mediated by SULTIA3 may play an important role in phaseⅡmetabolic in vivo.

apigenin; SULT1A3; sulfation; kinetic characterization

國家自然科學基金資助項目(81173123)；遼寧省自然科學基金課題(2013021080)

蔣昆諭，女，碩士，助教，研究方向：藥物吸收與代謝特性，E-mail：cmu_kyjiang@163.com；孟勝男，通訊作者，女，博士，教授，研究方向：藥物制劑及藥物吸收與代謝特征，E-mail：shnmeng_16@163.com。

R963

A

1005-1678(2015)03-0153-03