肝龍膠囊中總肽含量及其分子量分布的研究

那凱歌,滿紅霞,譚巧云,楊永壽,肖培云Δ

(1.大理學院 藥學院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000)

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肝龍膠囊中總肽含量及其分子量分布的研究

那凱歌1,滿紅霞1,譚巧云1,楊永壽2,肖培云1Δ

(1.大理學院 藥學院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000)

目的 建立高效空間排阻色譜(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)分析方法，測定肝龍膠囊中分子量分布并采用Lowry法測定其總肽含量。方法 采用superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm)色譜柱，以pH=6.0、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液為流動相，其中含有0.1 mol/L的NaCl；流速為0.7 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長214 nm。結果 總肽含量測定的線性范圍為0.08～0.4 mg，r=0.9996；含量精密度試驗的RSD為0%(n=6)，重復性試驗的RSD為1.1%(n=6)。標準物質分子量的回歸方程為logMr=5.1455-0.0871tR,r=0.9983, 分子量的線性范圍為2.68×102～5.73×103Da,分子量精密度試驗RCD為0.08%,重復性試驗RSD為1.3%。結論 該方法準確、簡便、快速，可作為肝龍膠囊的質量控制方法。

肝龍膠囊；空間排阻色譜法；總肽含量；分子量分布

“肝龍膠囊“是由藥用昆蟲美洲大蠊研發而成的昆蟲類抗乙肝病毒(HBV)中藥二類新藥，美洲大蠊(Periplaneta americana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲,俗稱“蟑螂”，其入藥始載于《神農本草經》[1]，具有抗腫瘤、抗病毒、促進組織修復等作用[2-3]。研究表明，“肝龍膠囊” 具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝損傷、減少肝組織中MDA以及肝損傷后的大鼠血清中ALT、AST等指標含量的作用，用于治療慢性乙型肝炎[4-6]。“肝龍膠囊”可抑制雛鴨體內鴨乙型肝炎病毒DNA的復制，可通過降低SGPT值發揮預防、保護肝損傷的作用[7]，并能增強機體免疫功能等作用[8]。“肝龍膠囊”的主要成分由肽、糖肽和氨基酸組成[9-11]，但其質量標準中缺乏對其分子量和總肽含量的測定方法，為了更好控制肝龍膠囊的質量，保證臨床用藥的安全、可控性，本文分別采用HPSEC法和Lowry法對其分子量、總肽含量分布進行檢測，以期為“肝龍膠囊”的質量控制提供快速、可靠的檢測方法，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品 牛胰島素(美國sigma公司，活力>27 U·mg-1，Mr=5733.49)；VB12(上海伯奧生物科技有限公司，含量≥98%，批號：080623，Mr=1355.37)；肌苷(上海藍季科技發展有限公司，含量≥98%，批號：110115，Mr=268)；小牛血清白蛋白(北京索萊寶生物科技有限公司，含量≥98%，批號：703J051)；肝龍膠囊(昆明賽諾制藥有限公司，批號：14012002、13101701、13062401)。

1.2 儀器與試劑 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司，包括G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B紫外檢測器)；UV2500紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限責任公司)；SK3200LH型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；KL-UP-UV-20型超純水機(成都康寧實驗專用純水設備廠)；AL240-IC型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。氯化鈉(天津市瑞金特化學品有限公司，批號：20120427)；磷酸氫二鈉(上海埃彼化學試劑有限公司，批號：F20131220)；磷酸二氫鈉(北京鳳翔科技有限公司，批號：20110805)；氫氧化鈉(天津市福晨化學試劑廠，批號：20140818)；無水碳酸鈉(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20120406)；硫酸銅(廣州市番禺力強化工廠，批號：20130219)；四水合酒石酸鉀鈉(杭州富強化工儀器有限公司，批號：20140310)；肝龍膠囊(昆明賽諾制藥有限公司，批號：14012002、13101701、13062401)。

1.3 色譜條件 色譜柱為superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm)凝膠柱；流動相為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6.0，含有0.1 mol/LNaCl)；流速為0.7 mL/min；柱溫 25 ℃；檢測波長214 nm。

1.4 供試品溶液的制備：取肝龍膠囊內容物0.05 g，加入蒸餾水超聲溶解，搖勻，定容至5 mL。過濾，除去輔料，用0.22 μm濾膜過濾后，用于分子量測定。取內容物0.02 g，精密加入蒸餾水4 mL，渦旋混勻，離心15 min，取上清液，用于含量測定。

1.5 對照品溶液的制備：稱取標準物質牛胰島素、VB12、肌苷適量，制成濃度分別為2 mg/mL、0.35 mg/mL、1 mg/mL的單標溶液，用于分子量測定。精密稱取小牛血清白蛋白(ABS)標準品0.02 g，置于100 mL量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，即得200 μg/mL的對照品溶液，用于含量測定。

1.6 含量測定方法學考察[12]

1.6.1 線性考察：精密移取ABS對照液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL置于10 mL量瓶中，加蒸餾水至2 mL，向其中分別加入堿性銅試劑(含0.5 moL/L NaOH，10% Na2CO3，0.1% NaKC4H406和0.05% CuSO4)1 mL，混勻，35 ℃溫育10 min，取出冷卻，向其中依次快速加入福林酚試劑B溶液(自制，取用時稀釋8倍)4 mL，混勻，于55 ℃反應15 min，流水進行冷卻。以對照液0 mL濃度為空白，照分光光度法(《中國藥典》2010年版一部附錄V A)于760 nm波長處測定吸光度。

1.6.2 精密度考察:取ABS液1.0 mL，同“1.4”項下處理方法，連續測定6次，以吸光度A考察該方法精密性。

1.6.3 重復性考察:取膠囊內容物約0.02 g，按“1.4”項下的方法平行制備6份供試品溶液，依法測定。以多肽含量(mg/粒)考察該方法重復性。

1.6.4 穩定性考察:分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 h測定供試品溶液，以吸光度A考察該方法穩定性。

1.6.5 回收率考察：取膠囊內容物約0.01 g，按下表加入對照品，精密移入蒸餾水4 mL，渦旋混勻，離心15 min。精密吸取上清液0.2 mL進行測定。

1.6.6 樣品含量測定：取3批樣品，按已知方法制備供試品溶液，每批次平行3份，依法測定3。

1.7 分子量檢測方法考察

1.7.1 標準曲線的繪制：吸取“1.5”項下的各單標溶液適量，混勻，過0.22 μm濾膜，按已知條件進樣25 μL，記錄色譜圖。

1.7.2 精密度考察：取“1.5”項下的標準物質牛胰島素(2 mg/mL)溶液，按已知色譜條件連續進樣6次，進樣量10 μL，以tR(min)考察該測定方法的精密度。

1.7.3 重復性考察：將同一批供試品溶液按已知條件在0 h重復測定6次，以tR(min)考察該方法重復性。

1.7.4 穩定性考察：將供試液分別在0、6、12、24、36 h進樣，以tR(min)考察方法的穩定性。

1.7.5 供試品分子量測定：取三批肝龍膠囊試樣，按“1.4”項下的方法制備供試液，按上述色譜條件進樣20 μL，分別測定各組分峰的tR。將樣品各峰的tR代入回歸方程計算其平均分子量。

2 結果

2.1 總肽含量的測定

2.1.1 線性考察：以吸光度A對含量m(mg)進行線性回歸，得標準曲線：A=1.9755 m+0.0775，r=0.9996(n=6)，見圖1。色譜圖，見圖2。

圖1 ABS線性回歸圖Fig.1 Linear regression graph of ABS

圖2 供試品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of sample

2.1.2 精密度考察：以吸光度A考察該方法精密性，RSD=0%，表明儀器的精密度良好。

2.1.3 重復性考察：重復性考察得平均含量為78.69 mg/粒，RSD=1.1%(n=6)。

2.1.4 穩定性考察：RSD=0.23%，表明該方法穩定性良好，。

2.1.5 回收率考察：回收率考察結果，見表1。

表1 回收率結果(n=6)Tab.1 Results of recovery(n=6)

2.1.6 樣品含量測定：樣品含量測定結果，見表2。

表2 肝龍膠囊總肽含量(n=3)Tab.2 The peptide content of Ganlong capsule (n=3)

2.2 分子量的測定

2.2.1 標準曲線的繪制：以標準物質出峰時間為橫坐標，分子量的對數值(logMr)為縱坐標繪制標準曲線。由此得回歸方程為logMr=5.1455-0.0871tR，r=0.9983，見圖3。色譜圖，見圖4。

圖3 標準物質線性回歸圖Fig.3 Linear regression graph of references

.對照品(1、2、3分別代表牛胰島素、VB12、肌苷)圖4 標準物質HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of references

2.2.2 精密度考察：經計算精密度RSD為0.08%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性考察：經計算重復性RSD為1.3%，表明方法的重復性性良好。

2.2.4 穩定性考察：結果表明穩定性tR為1.4%，表明該方法穩定。

2.2.5 供試品分子量測定：供試品色譜圖見圖2，供試品分子量測定結果，見表3。

表3 樣品分子量分布結果(n=3)Tab.3 Molecular weight distribution in sample(n=3)

3 討論

本實驗對分子量測定過程中的柱溫和流速進行了考察，分別考察20、25、30 ℃以及0.6、0.7、0.8 mL/min的流速。結果表明，柱溫和流速對檢測結果無顯著影響。由于凝膠色譜柱對柱壓要求有嚴格的限定，經綜合分析，本實驗采用流速為0.7 mL/min、柱溫25 ℃的條件進行測定。

本實驗曾嘗試以乙腈-水(含0.1%TFA)體系作為流動相進行測定，樣品色譜圖分離較好。而在選擇牛胰島素作為標準物質時，該物質色譜峰的峰形對稱性較差，且乙腈的毒性大，價格貴，因此本實驗最終選擇磷酸鹽緩沖液作為流動相。

測定總肽時，所用的堿性銅試劑需現用現配。由于福林酚試劑僅在酸性條件下穩定，但還原反應需在pH=10的條件下進行。故在加入福林酚試劑B時，應嚴格控制加入時間，且需立即混勻，以便磷鉬酸-磷鎢酸試劑在被破壞之前，發生還原反應。

本文采用HPSEC法測定總肽含量及肝龍膠囊分子量，具有操作簡便、分析速度快等優點，適用于限度檢查及相關物質的分析，可為肝龍膠囊的質量控制方法提供參考。

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(編校：王冬梅)

Research on the determination of molecular weight distribution and the peptide content of Ganlong capsule

NA Kai-ge1,MAN Hong-xia1,TAN Qiao-yun1,YANG Yong-shou2,XIAO Pei-yun1Δ

(1.Faculty of Pharmacy, Dali University, Dali 671000, China; 2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali 671000, China)

ObjectiveTo establish the molecular weight distribution of Ganlong capsule by HPSEC the content of the peptide determined by Lowry and MethodsThe superdex peptide 10/300 GL (10 mm×300 mm) column was used.The pH=6.0 and phosphate buffer of 0.05 mol/L was used as the mobile phase, containing 0.1 mol/L NaCl.The flow rate was set at 0.7 mL/min;The column temperature was 25 ℃;The detection wavelength was 214 nm.ResultsThe content of the peptide ranged from 0.08 mg to 0.4 mg(r=0.9996).The RSDs of measurement precision of molecular weight and content were 0.08% and 0%(n=6), respectively.The RSDs of the repeatability were 1.3% and 1.1%(n=6);The regression equation of standard material was logMr =5.1455-0.0871tR,r=0.9983,the relative molecular weight ranged from 2.68×102Da～5.73×103Da(r=0.9983).Conclusionon The method is simple and rapid for determining the peptide content and the molecular weight distribution of Ganlong capsule.It can be used quality control method for Ganlong capsule.

Ganlong capsule; size exclusion chromatography; peptide content; molecular weight distribution

國家自然科學基金項目(81360634, 81060329)；云南省教育廳重點項目(2011z053)

那凱歌，女，碩士，研究方向：生物藥物分析，E-mail：599175992@qq.com；肖培云，通訊作者，女，教授，研究方向：藥用昆蟲研究，E-mail：xpy990120@126.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)03-0159-03